Un nicho físico simbiótico en Drosophila melanogaster regula la asociación estable de un multi

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1557 (2023) Citar este artículo

3968 Accesos

3 citas

70 altmétrico

Detalles de métricas

El intestino es invadido continuamente por diversas bacterias de la dieta y el medio ambiente, pero la composición del microbioma es relativamente estable en el tiempo para especies hospedadoras que van desde mamíferos hasta insectos, lo que sugiere que factores específicos del hospedador pueden mantener selectivamente especies clave de bacterias. Para investigar la especificidad del huésped, utilizamos la gnotobiótica Drosophila, protocolos de seguimiento de pulsos microbianos y microscopía para investigar la estabilidad de diferentes cepas de bacterias en el intestino de la mosca. Mostramos que un nicho físico construido por el huésped en el intestino anterior se une selectivamente a las bacterias con especificidad a nivel de cepa, estabilizando su colonización. Los colonizadores primarios saturan el nicho y excluyen a los colonizadores secundarios de la misma cepa, pero la colonización inicial por especies de Lactobacillus remodela físicamente el nicho mediante la producción de una secreción rica en glicanos para favorecer la colonización secundaria por comensales no relacionados del género Acetobacter. Nuestros resultados proporcionan un marco mecanicista para comprender el establecimiento y la estabilidad de un microbioma intestinal de múltiples especies.

La salud del huésped se ve afectada por la composición del microbioma intestinal, específicamente qué especies y cepas de bacterias ocupan el intestino1,2,3,4,5. El microbioma se establece y se mantiene frente a las fluctuaciones diarias en la dieta, la invasión de patógenos6 y las alteraciones causadas por los antibióticos7. Muchas bacterias residentes en el intestino se localizan en regiones específicas del intestino que corresponden a ambientes químicos que coinciden con el metabolismo de la especie específica8. Ciertos probióticos, a saber, las especies de Lactobacillus, además crean uniones físicas con el moco del huésped, estabilizando su colonización9,10. Con una diversidad a nivel de cepas de cientos a miles11, sigue siendo enigmático cómo un huésped puede seleccionar y mantener un conjunto específico de cepas. Una hipótesis es que el mantenimiento a largo plazo de la dieta y los hábitos de vida refuerzan la estabilidad del microbioma12,13,14,15,16, mientras que otra hipótesis no exclusiva es que el huésped construye nichos físicos en el intestino que adquieren y secuestran bacterias simbióticas específicas17. 18,19,20,21,22.

El microbioma de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha estudiado durante más de un siglo y su composición es relativamente simple en comparación con el microbioma intestinal de los mamíferos23, pero aún no está claro cómo se regula el ensamblaje del microbioma intestinal de la mosca. Al igual que las criptas colónicas de los mamíferos, el intestino de las moscas es microaeróbico y está colonizado por bacterias de la clase Lactobacillales y del filo Proteobacteria22,24,25,26. Las moscas pueden criarse fácilmente sin gérmenes y luego asociarse con cepas bacterianas definidas, lo que proporciona un alto nivel de control biológico27. Además, el microbioma intestinal de la mosca tiene una diversidad baja, con ~5 especies de colonizadores estables de dos grupos principales: los géneros Lactobacillus (filo Firmicutes), que recientemente se dividió en Lactiplantibacillus y Levilactibacillus, y Acetobacter (clase α-Proteobacteria)26,28 . Estas especies se cultivan fácilmente, son genéticamente tratables27 y afectan la vida útil, la fecundidad y el desarrollo de las moscas29,30,31,32,33,34,35. Si bien durante mucho tiempo se ha argumentado que la colonización del intestino de las moscas no está regulada específicamente por mecanismos de filtrado del huésped, incluidas las preferencias alimentarias, la inmunidad y la digestión, la evidencia reciente sugiere que las moscas también pueden adquirir selectivamente cepas de Lactobacillus y Acetobacter en la naturaleza24,36, y estas puede proporcionar nutrición a las moscas durante la fase larvaria37.

Aquí, descubrimos un nicho físico dentro del intestino anterior de Drosophila adulto que está específicamente colonizado por cepas silvestres de Lactobacillus y Acetobacter. Caracterizamos la especificidad espacial del nicho, la especificidad de la cepa bacteriana para la colonización y la estabilidad de la colonización. Medimos efectos prioritarios que regulan el orden en que colonizan las especies bacterianas. Finalmente, medimos la respuesta del nicho a los colonizadores bacterianos, incluidos los cambios físicos y la glicosilación de la matriz extracelular.

En trabajos anteriores, examinamos una variedad de cepas bacterianas asociadas con D. melanogaster24 capturada en el laboratorio o en la naturaleza, identificando un subconjunto de cepas bacterianas que colonizan eficientemente el intestino de las moscas de laboratorio. Para investigar si las bacterias comensales forman asociaciones estables con el intestino de la mosca de una manera consistente con la existencia de un nicho, expusimos moscas a un inóculo cuantificado de células bacterianas marcadas con una proteína fluorescente (Fig. S1A-G). Después de la inoculación, las moscas se transfirieron a alimentos libres de gérmenes diariamente durante 3 días, seguido de una transferencia adicional a un nuevo vial libre de gérmenes durante 3 h para permitir que las bacterias transitorias se eliminaran del intestino (“Métodos”, Fig. S1). La limpieza previa al análisis redujo el número total de bacterias intestinales y la variación espacial en la ubicación bacteriana (Fig. S1H-J). Estos experimentos revelaron que una cepa de Lactiplantibacillus plantarum (Lp) aislada de una mosca silvestre (LpWF) persiste exclusivamente en el intestino anterior de D. melanogaster (Figs. 1A-D, S1I,J), incluido el proventrículo (una región luminal que conecta el esófago con el intestino medio anterior38), el buche (un apéndice en forma de saco) y el conducto del buche que conecta el buche con el proventrículo. Bacterias asociadas con surcos longitudinales que recubren la superficie de la luz interna del proventrículo, el conducto del buche y la base del buche (Fig. 1C-D, S1J). Se produjeron patrones espaciales de colonización similares en hembras adultas apareadas, hembras vírgenes y machos adultos (Fig. S2A-J), lo que indica que las diferencias específicas de cada sexo no afectan el fenotipo. No se observó colonización en las larvas después de la limpieza, lo que indica que el fenotipo es específico del intestino anterior adulto (Fig. S2K-M). Nos centramos en hembras adultas apareadas en todo momento porque se ha demostrado que exhiben una baja variación entre moscas en los fenotipos intestinales39,40,41.

Un esquema del ensayo de colonización con dosificación inicial el día 0 y transferencias en serie a alimentos estériles diariamente durante 3 días antes del análisis. B Diagrama intestinal. C La microscopía de la colonización de LpWF-mCherry en un intestino completo después de eliminar las células transitorias muestra una zona de colonización específica en el intestino anterior. Se muestra una proyección z de máxima intensidad. D El proventrículo es un sitio importante de colonización de LpWF. La colonización de E Ai también es específica de la luz del proventrículo y del conducto del buche (ver también Fig. S2). F Densidades de UFC de regiones disecadas en B. n = 23 intestinos individuales/región de tres réplicas biológicas. Las columnas representan medias. Las barras de error son SD G Se realizó microcirugía para eliminar el buche. H LpWF coloniza el intestino anterior de las moscas sin el buche (n = 15/15). I Corte transversal TEM de la luz interna del proventrículo. Imagen representativa de n = 3 réplicas biológicas. J Detalle de (I). Las barras de escala se definen en los paneles de figuras. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

De manera similar a LpWF, una cepa de Acetobacter indonesiensis colonizó las mismas regiones del intestino anterior (Figs. 1E, S2, S3), lo que indica que los dos grupos principales de bacterias intestinales de moscas tienen la misma especificidad espacial en el intestino anterior. Por el contrario, las moscas colonizadas con Lp de moscas de laboratorio (LpLF) (Fig. S1K, L) o la cepa LpWCFS1 aislada de humanos (Figs. S1M, S2A-J) exhibieron niveles de colonización mucho más bajos. No se encontraron cepas de Lp en abundancia sustancial en el intestino medio u otras regiones de la mosca después de eliminar las bacterias transitorias. De acuerdo con la microscopía, la densidad de bacterias vivas fue mayor en el proventrículo, seguido por el buche, y fue más baja en el intestino medio y posterior (Figs. 1F, S1N). Además, validamos que LpWF mantiene una colonización estable en ausencia de ingestión de nuevas células bacterianas durante 5 días durante los cuales las bacterias no adherentes fueron eliminadas del intestino manteniendo meticulosamente la esterilidad de los alimentos utilizando un alimentador CAFÉ24 (Fig. S4A, B).

Una población bacteriana en el intestino anterior con la localización espacial observada podría mantenerse mediante la proliferación y la resiembra constante del cultivo, en cuyo caso las moscas sin cultivos no podrían colonizarse de manera estable. Realizamos microcirugía para eliminar el cultivo de moscas libres de gérmenes (Fig. 1G, "Métodos"), las inoculamos con LpWF 5 días después de la cirugía y luego diseccionamos y tomamos imágenes del intestino 5 días después de la inoculación (dpi). Se validó el éxito quirúrgico y la porción restante del conducto del buche tenía una cicatriz melanizada en el sitio de la cirugía (Fig. 1H). Todas las moscas sin cultivos fueron colonizadas de manera estable por LpWF (n = 15/15), con una alta densidad de bacterias en la luz interna del proventrículo como en las moscas con un cultivo intacto (Fig. 1C). Observamos una colonización de Ai similar después de la cropectomía (n = 14/14 colonizados, Fig. S3E, F). Al examinar más a fondo estas regiones, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la luz del proventrículo reveló una geometría de tejido consistente (Fig. 1I, J), con células bacterianas densamente empaquetadas orientadas longitudinalmente en surcos alargados formados por cuerpos celulares del huésped que forman un promedio de 11 crestas. por sección transversal (Fig. S4C).

Por lo tanto, el cultivo no es necesario para la colonización estable del intestino anterior por LpWF o Ai, lo que sugiere que la capacidad de unirse específicamente al proventrículo y al conducto del buche es clave para una asociación bacteriana estable.

Se esperaría que un nicho diera como resultado una fuerte asociación bacteriana basada en sitios de unión específicos, de modo que el tamaño de la población bacteriana asociada se saturaría en un valor bien definido. Además, se esperaría que las células que ya están unidas al proventrículo promuevan la estabilidad de la población y prevengan la colonización de bacterias que lleguen más tarde. Para probar estas hipótesis, colonizamos moscas libres de gérmenes con una variedad de dosis de LpWF-mCherry y medimos la abundancia a lo largo del tiempo. Como se predijo, en una amplia gama de tamaños de inóculo inicial, la población bacteriana asociada se saturó a ~104 UFC/mosca (Fig. 2A). Además, cuando el tamaño del inóculo estaba por debajo de ese nivel de saturación, la población de bacterias en el proventrículo aumentó gradualmente y se estabilizó en 5 días. Las mediciones de crecimiento en moscas vivas24 demostraron que la meseta se alcanzó mediante el crecimiento de la población inicialmente unida en lugar de la ingestión de células adicionales. Por el contrario, cuando inicialmente se suministró un exceso de bacterias, la población disminuyó al mismo valor de meseta dentro de 1 día (Fig. 2A), lo que indica que el nicho tiene una capacidad de carga finita y fija. Se observó una dinámica similar para Ai con ~ 103 células en densidad saturada (Fig. S3G).

Se produce una saturación durante el transcurso del tiempo de colonización de moscas libres de gérmenes por parte de LpWF. Los puntos de datos son la media de log10(UFC) en n ≥ 48 moscas/punto de datos. Las barras de error representan 1 sem. Recuadro: transcurso de 20 días después de la inoculación con 106 UFC (datos de 24). B Diseño experimental de persecución de pulsos bacterianos: las moscas primero se precolonizaron con LpWF-mCherry y luego se alimentaron diariamente con un exceso de LpWF sin etiquetar (azul) con alimentos frescos. C Recambio de células actuariales cuantificado mediante el transcurso del tiempo de seguimiento de pulsos de moscas precolonizadas con Lp-mCherry alimentadas continuamente con LpWF sin marcar o moscas precolonizadas con Ai-GFP alimentadas continuamente con Ai sin marcar. Los puntos de datos son la media de log10(UFC) en n ≥ 34 moscas/punto de datos. Las barras de error representan 1 sem D Eficiencia de colonización cuantificada por dosis respuesta a la colonización de moscas individuales. Las UFC se midieron a 3 ppp del segundo colonizador. n = 24 moscas/dosis, las barras de error representan 1 error estándar de la proporción. Límite de detección: 50 UFC. E Estructura espacial de la dinámica de colonización en el proventrículo para una mosca precolonizada con LpWF-mCherry (rojo) invadida por LpWF-GFP y fotografiada 1 h después de la inoculación (hpi). F Corte óptico x,z. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar la estabilidad de la colonización bacteriana en el proventrículo, realizamos un experimento de persecución de pulsos en el que desafiamos a moscas precolonizadas con LpWF-mCherry con LpWF sin marcar alimentado en exceso durante 10 días (Fig. 2B). Los niveles de LpWF-mCherry en el intestino disminuyeron >90% durante los primeros 5 días, de ~104 a ~103 UFC/mosca, y luego permanecieron en ~103 UFC/mosca durante los siguientes 5 días (Fig. 2C), lo que indica una población pequeña y unida con poca rotación y una población asociada más grande con una vida media de 2,5 días (intervalo de confianza (ci) del 95%: 1,6 a 4,3 días). Por el contrario, LpWCFS1, un aislado humano de L. plantarum débilmente colonizador, fue rápidamente eliminado del intestino (Fig. 2C). Se observaron dinámicas similares en Ai (Fig. 2C, S3H) con una vida media de 2,5 días (95% ci 1,3–6,5 días), lo que indica que el nicho tiene una cinética equivalente para ambas especies bacterianas.

La unión inicial al nicho es un paso clave en el establecimiento de una nueva población bacteriana antes de llenar el nicho. El establecimiento depende de la dosis24, y nuestro hallazgo de que la abundancia final de colonizadores tardíos es menor que la de los colonizadores iniciales (Fig. S4D) sugirió que la presencia de colonizadores anteriores cambiaría la curva dosis-respuesta. Para cuantificar tales efectos prioritarios, alimentamos con una variedad de dosis de LpWF-mCherry a moscas individuales precolonizadas con LpWF y medimos el porcentaje que fueron colonizadas por LpWF-mCherry 3 días después. De acuerdo con nuestra hipótesis, las moscas precolonizadas tenían menos probabilidades que las moscas libres de gérmenes de ser colonizadas por una dosis igual de LpWF-mCherry: se requirieron ~103 UFC de LpWF-mCherry para que el 50% de las moscas fueran colonizadas, mientras que el 100% de las las moscas libres de gérmenes terminaron colonizadas con dosis tan bajas como 102 UFC (Fig. 2D). Estos hallazgos demuestran que el nicho proventricular para LpWF, cuando está ocupado, resiste fuertemente la colonización por dosis posteriores de la misma cepa.

La relación entre la probabilidad de establecimiento y la abundancia final de bacterias colonizadoras exitosas sugiere que la disponibilidad de hábitats abiertos regula la posibilidad de invasión. Formalizamos los supuestos de esta hipótesis construyendo una teoría integrada de colonización inicial24 y saturación de nicho42 que predice la probabilidad de colonización, \(P\left({N}_{0}\right)\), de una especie invasora inoculada en un dosis de \({N}_{0}\) en función de la abundancia final de la especie invasora, \({A\left (\right. N}_{0}\left )\right.\):

donde \(p\) es la probabilidad de colonización de una célula bacteriana individual y \(k\) es el tamaño de la subpoblación alcanzado en un único evento de colonización exitoso (Fig. S5A, B). Este modelo nos permitió estimar la escala en la que se estructura la población en función de las probabilidades de colonización y la abundancia bacteriana total. Para LpWF, la ecuación. 1 estima un tamaño de subpoblación de \(k\)=600 células (Fig. S5C), que es aproximadamente el número de células contenidas en un surco individual.

Para probar si la dosis posterior de LpWF-mCherry fue excluida espacialmente por el LpWF residente, construimos una cepa de LpWF que expresa GFP y la alimentamos a moscas precolonizadas con LpWF-mCherry. Tomamos imágenes de intestinos fijos completos 1 h después de la inoculación (hpi) para capturar células LpWF-GFP antes de que salieran de la mosca (Fig. 2E). En el proventrículo, la LpWF-GFP invasora se localizó a lo largo del eje central de la luz interna, separada de la pared de la luz por una capa de LpWF-mCherry residente (Fig. 2E, F) que tenía hasta 10 µm de espesor. Los surcos del proventrículo posterior estaban densamente llenos de LpWF-mCherry, mientras que LpWF-GFP estuvo en gran medida ausente de los surcos, lo que sugiere que estos surcos son sitios de colonización estable. Confirmamos que los fluoróforos no son responsables de la colonización diferencial al alimentar con LpWF-mCherry a moscas precolonizadas por LpWF sin marcar y cuantificar la señal de mCherry a lo largo del intestino a 1 hpi y 24 hpi. A 24 hpi con una dosis de ~ 104 UFC, las moscas precolonizadas por LpWF mostraron mCherry casi indetectable mediante microscopía (Fig. S4E-H). Estos resultados respaldan aún más que el nicho para LpWF está en los surcos proventriculares. A diferencia de la colonización inicial, en la que las bacterias entran y colonizan rápidamente los surcos, los colonizadores anteriores impidieron la colonización posterior, lo que sugiere que hay un número limitado de sitios de unión en los surcos para las células LpWF y que estos sitios están saturados por la colonización previa. De acuerdo con esta lógica de que la prioridad de nicho está determinada espacialmente, en los casos en que LpWF-GFP mostró colonización (n = 5), las células marcadas con GFP se ubicaron entre sí a lo largo de un surco en lugar de mezclarse uniformemente con mCherry (Fig. .S4I).

Las interacciones entre especies pueden tener impactos importantes en la colonización de ecosistemas a través de efectos prioritarios que incluyen la exclusión y facilitación competitiva43,44,45,46,47. Debido a que Ai y LpWF colonizan la misma ubicación general del intestino (Figs. 1C – F, S3A – D) y cada cepa se excluye a sí misma (Figs. 2D, 3A), esperábamos que se excluyeran entre sí. Para probar esta hipótesis, medimos la abundancia y la tasa de crecimiento de cada especie durante la co-colonización. Para nuestra sorpresa, ninguno de los dos se vio afectado (Figs. 3B, C, S6), lo que demuestra que las especies saturan el nicho de forma independiente. También realizamos un ensayo de dosis-respuesta para determinar si las interacciones afectan el establecimiento de nuevos colonizadores. En contraste con la autoexclusión de Ai, la precolonización de LpWF facilitó la colonización de Ai (Fig. 3A), mientras que la colonización de LpWF no se vio afectada por la presencia de Ai (Fig. S6A-C). A. pasteurianus, una especie filogenéticamente distinta de Acetobacter48 que es común en D. melanogaster49, también fue facilitada por LpWF (Fig. S6D). El LpWF muerto por calor no facilitó la colonización de Ai, lo que indica que se necesitan células LpWF vivas para facilitar la colonización de Ai (Fig. S7A, B).

Las interacciones entre cepas influyen en la eficiencia de la colonización, como se ve en las curvas de dosis-respuesta para Ai alimentada a moscas libres de gérmenes (círculos verdes abiertos), moscas precolonizadas con Ai (círculos amarillos rellenos) o moscas precolonizadas con Lp (círculos negros). cuadrados verdes llenos). Prueba Z de diferencias en proporción versus Ai en moscas libres de gérmenes: dosis 102,3 UFC/mosca, p = 8,1×10−4; dosis 103,7 UFC/mosca: p = 4,8 × 10−9; dosis 105 UFC/mosca: p = 8,7 × 10−6. n ≥ 12 moscas/punto de datos. Las barras de error representan 1 error estándar de la proporción. B La abundancia de Ai a 5 ppp no ​​difiere entre moscas monocolonizadas con Ai versus moscas precolonizadas con LpWF y luego alimentadas con Ai. n ≥ 65 moscas/tratamiento; prueba t no pareada de dos colas, p = 0,38; ns indica no significativo. La abundancia de C LpWF a 5 ppp no ​​difiere entre moscas monocolonizadas con LpWF y moscas precolonizadas con Ai y luego alimentadas con LpWF. n ≥ 53 moscas/tratamiento; prueba t no apareada de dos colas; p = 0,06; ns indica no significativo. B, C: el centro del cuadro es la mediana; el cuadro incluye los percentiles 25 a 75; los bigotes indican mínimo y máximo. D Microscopía confocal de co-colonización de Lp y Ai. Ai (verde) y LpWF (rojo) ocuparon las mismas regiones del intestino anterior 1 ppp. Barra de escala: 100 µm. Sección E, F x,z de los sectores Ai y LpWF. G Sección transversal de TEM de Ai y LpWF co-colonizando el proventrículo anterior. Barra de escala: 5 µm. H Detalle de (G) con células LpWF y Ai pseudocoloreadas. Barra de escala: 2 µm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La microscopía de fluorescencia de intestinos co-colonizados por LpWF-mCherry y Ai-GFP mostró que Ai y LpWF co-colonizaron las mismas regiones del intestino anterior (Fig. 3D), con sectores distintos de cada especie (Fig. 3E-H, Película complementaria 1) . Por tanto, LpWF y Ai no se excluyen físicamente entre sí; en cambio, el tejido se adapta a ambas cepas.

Para examinar la coexistencia de poblaciones superpuestas de Ai y LpWF en un espacio físicamente confinado, tomamos imágenes de la anatomía de la mosca utilizando tomografía microcomputada de rayos X (XR µCT)50,51 y segmentamos los datos de la imagen volumétrica para producir reconstrucciones 3D (Fig. 4A). Tomamos imágenes de moscas libres de gérmenes y de moscas colonizadas con LpWF, Ai o tanto LpWF como Ai. Se observaron numerosas criptas a lo largo del intestino, incluso en regiones no colonizadas del intestino medio y posterior que están protegidas por una matriz peritrófica (Figs. 4A, S8)52. En la región colonizada del intestino anterior, las estrías longitudinales donde observamos bacterias coincidieron con crestas y surcos del tejido del huésped en la luz interna del proventrículo y el conducto del buche (Fig. 4B-F). Los surcos eran rectos en el proventrículo anterior, volviéndose más grandes e irregulares en el posterior (Fig. 4D, F). Los cortes transversales de la pared de la luz revelaron un paso estrecho a través del proventrículo libre de gérmenes (Fig. 4C), mientras que la abertura era mucho más amplia en el proventrículo colonizado (Fig. 4E), correspondiente a un volumen luminal significativamente mayor que en los proventrículos libres de gérmenes. moscas (Fig. 4G).

Un modelo de rayos X µCT de una mosca entera. El corte muestra (1) proventrículo expuesto (también recuadro de (B)), (2) intestino medio anterior y (3) intestino medio posterior. B Detalle del proventrículo. C Corte transversal de la luz interna de un proventrículo libre de gérmenes. Barra de escala: 5 µm. D Representación del volumen de la luz interna del proventrículo libre de gérmenes. E Sección transversal de la luz interna del proventrículo colonizado por LpWF. Barra de escala: 5 µm. F Representación del volumen del lumen interno del proventrículo de LpWF. G Volumen cardiaco calculado a partir de modelos de superficie (n = 3 a 4 moscas por condición; p = 0,0025, ANOVA unidireccional relativo a libre de gérmenes; corrección de Tukey para comparaciones múltiples; GF vs. Lp p = 0,020; GF vs. Lp+ Ai p = 0,022.). H – M Microscopía electrónica de transmisión sección transversal del proventrículo anterior en (H) mosca libre de gérmenes, (I) mosca criada convencionalmente (solo bacterias de mosca de laboratorio; sin LpWF), ( J, K) 1 hpi con LpWF, ( L, M) 3 ppp colonizados con LpWF (ver Fig. S7). n ≥ 3 réplicas biológicas por tratamiento para TEM. Las puntas de flecha amarillas indican el espacio del lumen. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

De acuerdo con las imágenes XR µCT, las secciones transversales TEM del proventrículo de moscas libres de gérmenes mostraron un espacio luminal estrecho, de aproximadamente 0,5 µm de diámetro (Figs. 4H, S9). Se observó una morfología similar en moscas de laboratorio criadas convencionalmente, que están asociadas con cepas poco colonizadoras de la misma especie bacteriana, incluida L. plantarum24 (Fig. 4I). En las moscas colonizadas por LpWF, el diámetro de los surcos aumentó a ~1 µm por 1 hpi (Figs. 4J, K, S9) y ~2–3 µm por 3 ppp (Figs. 4L, M, S9E-J), lo que sugiere una respuesta sostenida del anfitrión a la ocupación de nichos. El LpWF destruido por calor no produjo esta expansión de nicho, lo que indica que las células LpWF vivas son necesarias para la expansión luminal (Fig. S7C-F). Por TEM, el espacio luminal expandido del proventrículo colonizado contenía dos zonas: una zona clara adyacente a la pared de la luz y una zona colonizada por bacterias más cercana al centro de la luz (Fig. 4L, M, S9E-J). La fijación por congelación a alta presión mostró los mismos fenotipos (Fig. S9S), lo que indica que la zonificación no es simplemente un artefacto de fijación. En conjunto, nuestros resultados de imágenes muestran que el proventrículo sufre cambios morfológicos tras la colonización, que coinciden con la promoción de la colonización de Ai.

El moco está fuertemente glicosilado, con varias subunidades de glucano que incluyen N-acetilglucosamina, N-acetilgalatosamina, ácido N-acetilneuramínico, manosa, glucosa, fucosa y arabinosa, según el tipo de moco53. Nuestra hipótesis es que la matriz extracelular (ECM) en la zona colonizada de la luz interna del proventrículo, como se ve en la sección delgada de TEM (Fig. 4, S9), es rica en glicanos. Para probar esta hipótesis, seccionamos el proventrículo y lo teñimos con un panel de lectinas que tienen especificidad por los glicanos que se encuentran en el moco (“Métodos”). La aglutinina de germen de trigo (WGA), la aglutinina de Dolichus biflorus (DBA) y la aglutinina de Lens culinarus (LCA) tiñeron células de mosca en las secciones del proventrículo, mientras que otras lectinas no mostraron una unión consistente al proventrículo (Fig. 5A). Al examinar la luz interna del proventrículo donde aparece la capa secretada mediante TEM (Fig. 4H-M, S9), observamos tinción mediante WGA (Fig. 5B). La tinción con DBA y LCA también estaba presente en la luz interna, pero las ubicaciones no correspondían con la capa secretada vista por TEM (Figs. S10A, B). WGA se une a N-acetilglucosamina y también puede unirse al ácido N-acetilneuramínico54, el principal ácido siálico que se encuentra en las células de los mamíferos. La aglutinina de Sambucus nigra, que se une a los ácidos siálicos, no se tiñó, lo que coincide con los informes publicados de que el ácido siálico se produce sólo en embriones de mosca55. El WGA succinilado (sWGA) se une solo a N-acetilglucosamina54 y exhibió un patrón de tinción consistente con las imágenes WGA y TEM de la capa secretada, lo que indica que la ECM de la luz interna es rica en N-acetilglucosamina (Fig. 5C). La quitina es un polímero de N-acetilglucosamina y también está presente una cutícula quitinosa permeable en el proventrículo38. El calcoflúor, que se une a la quitina, tiñó la cutícula, que se puede ver claramente entre las células epiteliales de la luz interna y la capa secretada, lo que indica que la capa secretada no es quitina (Fig. 5B, C). TEM sugirió que las moscas libres de gérmenes también tienen una capa secretada estrecha (Fig. 4H). Analizamos moscas libres de gérmenes y descubrimos que esta capa estrecha se tiñó con WGA, lo que indica que la N-acetilglucosamina es un glicano primario en la capa secretada de moscas libres de gérmenes (Figs. 5D, S10C). Para determinar si la capa podría ser producto de la quitina digerida de las paredes celulares de levadura en el alimento, seccionamos hembras vírgenes recién encerradas antes de su primera alimentación y descubrimos que la tinción de su proventrículo era consistente con moscas libres de gérmenes (Figs. 5E, S10D). , mi). Debido a que el proventrículo se forma a partir de un disco imaginal durante la puparia, nuestra evidencia indica que la ECM secretada rica en N-acetilglucosamina es claramente producida por la mosca.

Una tabla de lectinas que tiñeron el proventrículo. Tinción con lectina de secciones transversales del proventrículo para B WGA en una mosca colonizada, C sWGA en una mosca colonizada, D WGA en una mosca libre de gérmenes y E WGA en una mosca libre de gérmenes recién encerrada antes de la primera ingestión de alimentos. Barras de escala: 20 µm. Las puntas de flecha indican tinción con lectina en la luz interior del proventrículo. n ≥ 3 réplicas biológicas por tratamiento. CF: calcoflúor.

Nuestros resultados muestran que cepas específicas de bacterias intestinales de Drosophila colonizan surcos similares a criptas en el proventrículo, que la colonización por estas cepas es saturable, lo que sugiere un número limitado de sitios de unión, y que el proventrículo responde a la colonización mediante ingurgitación, lo que promueve la colonización por bacterias que benefician a la mosca32,33,56. El hallazgo de que Drosophila tiene un nicho específico para la unión de comensales a sitios en el conducto del buche y el proventrículo es importante porque proporciona información sobre cómo un microbioma puede interactuar con el huésped de una manera que puede ser regulada por el huésped y mutuamente beneficiosa. Además, predice la existencia de moléculas específicas en la matriz extracelular del proventrículo que se unen a la superficie bacteriana de cepas colonizadoras competentes pero no a cepas no colonizadoras. Aunque no hemos investigado las mucinas aquí, las moscas tienen mucinas57,58, y tres de ellas se expresan en el proventrículo52. Además, la morfología de la matriz extracelular en el proventrículo recuerda al moco de los mamíferos, que tiene dos capas: una capa densa, no colonizada, adyacente al epitelio, y una capa distal, más delgada, colonizada por bacterias59. Especulamos que las células de nicho en los surcos proventriculares producen el sustrato de adhesión para las bacterias o producen una matriz extracelular que secuestra el sustrato de adhesión de otra fuente, como la glándula salival. Las membranas aparentemente densamente apiladas observadas por TEM de las células del nicho (Fig. 1J) sugieren que pueden ser células secretoras, lo que es consistente con la naturaleza secretora extensa del proventrículo38. El hallazgo de que la unión de una cepa bacteriana puede conducir a cambios estructurales que abren nichos para una segunda especie bacteriana proporciona un modelo de cómo pueden surgir y mantenerse conjuntos complejos de cepas bacterianas dentro del tracto digestivo del huésped, seleccionando el huésped colonizadores primarios que a su vez seleccionan colonizadores secundarios. De hecho, L. plantarum es homofermentativo y previamente hemos demostrado que LpWF tiene una interacción metabólica positiva con cepas de Acetobacter que se encuentran en el intestino de la mosca, incluido Ai60.

A pesar de la larga historia de estudios sobre el microbioma de Drosophila, la existencia de un nicho específico ha quedado oscurecida por la presencia de bacterias en los alimentos y en los medios de cultivo tradicionales. Una fracción sustancial de las bacterias intestinales en tales condiciones simplemente pasan a través del intestino y no interactúan específicamente con él61, aunque puedan estar presentes miembros específicos del microbioma unidos a sus nichos asociados. Utilizamos protocolos de seguimiento de pulsos bacterianos para expulsar las bacterias libres. Este avance metodológico se enriqueció solo para células que interactúan específicamente, lo que nos permite identificar el nicho simbiótico.

La posesión de un microbioma es claramente muy beneficiosa para Drosophila, dado que las moscas axénicas muestran un crecimiento y una fecundidad muy reducidos29,30,31,32,62,63. Sin embargo, está menos claro cómo se perpetúa de manera estable la relación entre el huésped y cepas específicas de bacterias. Un estudio previo demostró que las larvas excretan N-acetilglucosamina en sus excrementos, proporcionando un nutriente que ayuda al crecimiento externo de L. plantarum en el alimento de las moscas37. Si bien no se determinó el origen de la N-aceilglucosamina excreta de las larvas, nuestros resultados indican que el nicho del proventrículo adulto está enriquecido en N-acetilglucosamina producida por moscas, lo que sugiere que el nicho proporciona tanto un hábitat espacial como una fuente nutricional para L. plantarum.

Es probable que comprender el nicho proventricular proporcione información sobre la función del microbioma al (1) revelar las ubicaciones espaciales donde las bacterias influyen en el huésped para introducir moléculas en el intestino, tal vez junto con la membrana peritrófica; y (2) revelar si los cambios en la estructura de nicho inducidos por una especie sientan las bases para asociaciones más complejas entre diferentes miembros del microbioma, como LpWF y Ai, que están relacionadas con sus vías funcionales. Finalmente, estas observaciones plantean la cuestión de si existen nichos adicionales en otras ubicaciones del sistema digestivo de Drosophila y dentro del intestino de otros animales, incluidos los humanos.

No se obtuvo ninguna aprobación ética porque los modelos de insectos no requieren aprobación ética según las leyes y regulaciones locales. Todas las moscas de este estudio eran hembras apareadas (excepto en la Fig. S2), que muestran una baja heterogeneidad en la morfología intestinal40. Trabajos anteriores demostraron que los fenotipos de colonización que medimos son generales en múltiples orígenes genéticos, incluidos CantonS, w1118 y OregonR24. Las moscas se criaron en viales anchos de Drosophila (n.º de cat.: 32-114, Genesee), con Droso-Plugs® (n.º de cat.: 59-201, Genesee). La composición de los alimentos fue 10% de glucosa (esterilizada por filtración), 5% de levadura viva esterilizada en autoclave, 0,42% de ácido propiónico (esterilizada por filtración), 1,2% de agar esterilizado en autoclave y 0,5% de harina de maíz esterilizada en autoclave. Cada vial contenía 4 ml de alimento. Las poblaciones de moscas libres de gérmenes se transfirieron a viales nuevos cada 3 a 4 días. El día antes de comenzar un experimento, se clasificaron hembras adultas apareadas de cinco días de edad.

El alimento líquido estaba compuesto por un 10% de glucosa, un 5% de extracto de levadura y un 0,42% de ácido propiónico. La única diferencia nutricional entre los alimentos líquidos y sólidos fue el extracto de levadura en lugar de la levadura viva esterilizada en autoclave porque las paredes celulares de la levadura obstruyen los capilares utilizados para la alimentación líquida. El fondo de los viales de alimentación capilar contenía 1,2% de agar como fuente de hidratación y humedad. Tanto las moscas alimentadas con CAFÉ como con alimentos sólidos se transfirieron diariamente a viales nuevos para minimizar la reingestión bacteriana. Se esterilizaron la superficie y se trituraron muestras de moscas, y se enumeraron las UFC.

Las cepas bacterianas se informaron en la ref. 24, incluidos Lactobacillus plantarum WF, L. plantarum LF y L. plantarum WCFS1, que se denominó L. plantarum HS en la ref. 24. Se analizó la colonización de Acetobacter indonesiensis SB003 en la Fig. S1 de la ref. 24. Se desarrollaron cepas de plásmidos fluorescentes que expresan proteínas y se informaron en las refs. 24,60. pCD256-p11-mCherry, utilizado para L. plantarum, fue un generoso regalo de Reingard Grabherr (BOKU, Austria)64. pCM62, utilizado para Acetobacter indonesiensis, fue un generoso regalo de Elizabeth Skovran (SJSU, EE. UU.).

El ensayo de colonización siguió el protocolo utilizado en la Fig. S1A de la ref. 24. Brevemente, se pipeteó una dosis medida de bacterias uniformemente sobre la superficie de un vial de alimento para moscas libre de gérmenes y se dejó absorber durante 15 minutos. Se introdujeron en el vial veinticinco moscas hembras apareadas, libres de gérmenes, de 5 a 7 días después de la eclosión, y se les permitió alimentarse durante un período de tiempo definido. Luego se retiraron las moscas del vial de inoculación y se colocaron en viales frescos y libres de gérmenes. Las bacterias se recogieron del vial de inoculación mediante enjuague vigoroso con PBS y la abundancia se cuantificó mediante UFC. En momentos específicos, las UFC en moscas individuales se contaron lavando las moscas 6 veces en etanol al 70%, seguido de enjuague en ddH2O y luego triturándolas y sembrando en placas para el recuento de UFC.

Los cultivos de bacterias se cultivaron durante la noche en 3 ml de medio líquido a 30 °C. Las cepas de Lp se cultivaron en medio líquido MRS (Hardy Diagnostics, n.º 445054) y se agregaron 10 µg/ml de cloranfenicol para las cepas que expresaban mCherry. Ai se cultivó en medio MYPL y se agregaron 25 µg/ml de tetraciclina para las cepas que expresan GFP. Las bacterias se sedimentaron mediante centrifugación durante 3 minutos a 400 x g, se resuspendieron en PBS y luego se diluyeron hasta la concentración deseada. El tamaño de la dosis se cuantificó utilizando OD600 o colocando en placas y contando las UFC. Una DO de 1,0 corresponde a 2 × 108 UFC/ml para LpWF y 3 × 108 UFC/ml para Ai.

Las moscas se inocularon pipeteando 50 µL de una concentración adecuada del inóculo sobre el alimento y luego se dejaron secar en la cabina de bioseguridad durante 15 minutos. Las moscas se mataron de hambre durante 4 h antes de colocarlas en los viales de inoculación, donde se les permitió alimentarse durante 1 h y luego se las volteó a viales nuevos. La dosis por mosca se calculó como la cantidad de inóculo consumido dividida por el número de moscas en el vial. Para verificar que las moscas se comieron las bacterias colocadas en la comida y medir la cantidad de inóculo ingerido, se recuperaron las bacterias no consumidas del vial después de la alimentación y se restaron de la dosis original. Para los experimentos para estandarizar la dosis de bacterias, utilizamos un vial cónico invertido de 50 ml con agar alimentario solidificado en la tapa, lo que permite la separación de las UFC de alimentos de las UFC en las paredes del vial. Para otros experimentos, utilizamos un vial ancho de polipropileno esterilizado en autoclave (Genesee).

Las larvas se colonizaron inoculando primero viales de alimento con 100 µl de cultivo bacteriano con una DO de 1. Se agregaron a los viales al menos 25 moscas hembra apareadas y se les permitió poner huevos durante 1 día, luego se retiraron. 3 días después, se recogieron larvas del tercer estadio y se lavaron en PBS, luego se transfirieron a viales estériles de agar-agua durante 4 h para eliminar las bacterias transitorias. Los intestinos de las larvas se diseccionaron por completo, luego se montaron en un medio de montaje (80 % de glicerol, 20 % de Tris 0,1 M, pH 9,0) y luego se tomaron imágenes usando un microscopio confocal para capturar una pila en z de todo el proventrículo.

La abundancia en el intestino se midió homogeneizando moscas enteras y luego sembrando en placas para contar las UFC. Las moscas se anestesiaron primero con CO2 y se esterilizaron la superficie lavándolas dos veces con etanol al 70% y luego dos veces con PBS. A continuación, se colocaron individualmente en pocillos de una placa de 96 pocillos junto con 100 µl de PBS y ~50 µl de perlas de vidrio de 0,5 µm (Biospec) y se sellaron térmicamente (Thermal Bond Heat Seal Foil, 4titude). La placa se agitó violentamente durante 4 minutos a velocidad máxima en un batidor de cuentas (Biospec Mini-beadbeater-96, #1001) para homogeneizar las moscas. Anteriormente demostramos que el tamaño de la perla de 0,5 µm no disminuye el recuento de bacterias y altera eficazmente el tejido de las moscas24. Se preparó una serie de diluciones de toda la placa utilizando un robot de manipulación de líquidos (Benchsmart). El medio de crecimiento agar se preparó en placas rectangulares, que se calentaron y secaron aproximadamente 30 minutos antes del cultivo. Las placas se inocularon con 2 µl de homogeneizado de mosca por pocillo, lo que da lugar a un parche circular para la enumeración de UFC. Las placas se incubaron a 30 °C durante la noche. Para contar las colonias, las placas se fotografiaron bajo luz fluorescente y se contaron de forma semiautomática utilizando ImageJ 2.1.065.

La cantidad de bacterias en un vial de mosca se midió recuperando células del vial y colocándolas en placas en medio de crecimiento de agar nutritivo (MRS o MYPL) para contar las UFC. Para recolectar las bacterias, se pipetearon 2 ml de PBS estéril en el vial. Luego se volvió a tapar el vial y se agitó durante 10 s. Se realizó una serie de diluciones comenzando con 100 µl del lavado de PBS y luego se sembró en placas para contar las UFC. Este método se utilizó para cuantificar las bacterias viables ingeridas (defecadas) por las moscas, o el crecimiento bacteriano en el vial o en el resto del inóculo no consumido. La egestión y la inoculación se midieron durante un período de 1 a 2 h, minimizando la oportunidad de nuevo crecimiento bacteriano.

Se colocaron doce moscas en un vial de polipropileno estéril de boca ancha que contenía 2 ml de agar al 1,2 % en ddH2O. Se insertaron cuatro tubos capilares de vidrio a través del flug y se llenaron con 12 µl de alimento líquido para moscas esterilizado con filtro (10 % de glucosa, 5 % de extracto de levadura, 0,42 % de ácido propiónico). Se agregaron diez microlitros de aceite de recubrimiento encima para empujar el alimento líquido hacia el fondo del capilar. Las moscas se dejaron en el vial durante 24 h antes de transferirlas a una configuración nueva. Los viales se revisaron cada 12 h para garantizar que las moscas tuvieran acceso a los alimentos, y se insertó un tubo nuevo con nuevos capilares si los capilares tenían aire, lo que impide el acceso a los alimentos. Se colocaron cinco viales para moscas en un vaso de precipitados de 1 litro con una toalla de papel húmeda en el fondo y papel de aluminio en la parte superior, y el vaso se colocó en la parte posterior de una incubadora de moscas a 25 °C, 12 h-12 h. ciclos de luz-oscuridad y 60% de humedad relativa.

Las bacterias LpWF se prepararon haciendo crecer un cultivo durante la noche en MRS + 10 µg/ml de cloranfenicol a 30 °C. El cultivo se sedimentó mediante centrifugación a 400 x g y luego se resuspendió en PBS a una DO de 2. Para matar las bacterias, se calentó 1 ml de la suspensión resultante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 65 °C durante 30 minutos en un equipo de EE. UU. Mini baño seco científico. Se extendió una muestra de la suspensión en una placa MRS y se incubó durante 2 días para confirmar que todas las células se destruyeron con éxito.

Para simular la colonización por LpWF vivo, las moscas fueron alimentadas diariamente con un exceso de bacterias muertas por calor durante 3 días. Las moscas hembra apareadas de 5 a 7 días de edad se mantuvieron a 25 moscas/vial, como en los otros experimentos de colonización. Cada día, se pipetearon 100 µl de la suspensión muerta por calor (4 × 107 UFC/vial) sobre alimentos frescos y estériles y se dejaron secar antes de transferir las moscas al vial. Para eliminar el exceso de bacterias muertas del nicho antes de realizar experimentos para evaluar el impacto en el huésped, las moscas se transfirieron a alimentos frescos estériles durante la noche y luego se eliminaron colocándolas en un medio de agar-agua durante 4 h antes de obtener imágenes o dosificar con Ai. A partir de este momento, los métodos fueron los mismos que si las moscas fueran colonizadas por nuestro método estándar.

Para estimar el tiempo de renovación de las poblaciones bacterianas establecidas, se mantuvieron moscas hembras apareadas de 5 a 7 días de edad con 25 moscas/vial. Primero se inocularon las moscas con un pulso de bacterias resistentes a los antibióticos marcadas con fluorescencia pipeteando 50 µl de cultivo resuspendido en PBS (OD600 = 1) sobre el alimento y dejándolo secar antes de colocar las moscas en el vial de inoculación. Se permitió que la dosis de pulso estableciera la colonización en el intestino durante 3 días antes de la persecución. Las moscas fueron alimentadas con una dosis de caza de la misma manera cada día durante 10 días (OD600 = 1). La abundancia de residentes marcados se midió diariamente homogeneizando y colocando en placas una muestra de moscas en medios selectivos para contar las UFC. La dosis de persecución invasora se ensayó sembrando en medios no selectivos. Para controlar cualquier otro factor que pudiera afectar la abundancia de los residentes, un grupo de control también pasó diariamente a alimentos frescos sin dosis de persecución y se analizó diariamente para contar las UFC.

Las mediciones de moscas individuales de los diferentes experimentos se agruparon por momento. Los datos se ajustaron a una caída exponencial utilizando Prism y se informó la vida media con su intervalo de confianza.

La pérdida de plásmido en ausencia de selección se utilizó como indicador de la tasa de crecimiento bacteriano24. Brevemente, se construyó una curva estándar pasando células que contenían plásmidos en medio fresco dos veces al día en una dilución de ~1:100 hasta una DO de 0,01 durante 6 días. El número de generaciones bacterianas se estimó contando el número de UFC en el cultivo antes de la dilución. La proporción de UFC que contienen plásmidos y UFC libres de plásmidos se contó como el número de colonias fluorescentes y no fluorescentes. El tiempo de duplicación es de aproximadamente 2 h para cada cepa. Se utilizó una regresión lineal para ajustar los datos de la curva estándar. Luego, las moscas fueron alimentadas con 100% de células que contenían plásmidos. La proporción de UFC que contienen plásmidos y libres de plásmidos se contó en varios puntos de tiempo y se usó la curva estándar para convertir la proporción en el número de duplicaciones. En el caso de las cepas que contienen plásmidos duales (Fig. S7C), el crecimiento se midió como una proporción de colonias positivas para los plásmidos GFP-Erm (que se pierden rápidamente) y aquellas positivas para mCherry-Cam (que se retiene por mucho más tiempo). Se utilizó una regresión no lineal (decrecimiento exponencial). Dos advertencias son que (1) los cuellos de botella de la población causan una variación más amplia en la proporción de plásmidos y (2) las tasas de pérdida de plásmidos in vivo pueden ser diferentes de las tasas in vitro. Anteriormente mostramos que la primera advertencia se puede utilizar para inferir cuellos de botella. También observamos que con respecto a la segunda advertencia, nuestro uso de este método para comparar tasas de crecimiento en un experimento controlado no requiere una medición de crecimiento absoluto con una curva estándar. Además, las tasas de crecimiento in vivo fueron similares a las in vitro, lo que significa que cualquier diferencia en las tasas de pérdida de plásmido debido a diferencias en la fase de crecimiento de las células probablemente sea pequeña.

La cropectomía se realizó en moscas vivas utilizando únicamente unas pinzas finas nuevas y sin daños (#5, Dumont). Las pinzas, el flypad y el área del microscopio se limpiaron con etanol al 70%. Primero se anestesiaron moscas hembra de cinco a diez días de edad con CO2 y luego se colocaron en un portaobjetos de depresión para realizar la cirugía. La mosca se colocó boca arriba y, mientras se sostenía el torso con un juego de fórceps, se realizó una pequeña punción en el abdomen, justo debajo del tórax, como se muestra en la Fig. 1O. Se liberó ligeramente la presión sobre las pinzas para permitir que las puntas se abrieran, luego se agarró el cultivo y se sacó a través de la punción. Si el conducto del buche todavía estaba adherido, se cortó a lo largo del borde con unas pinzas. Las moscas se colocaron en un vial de alimento estéril y se les dio al menos 3 días para recuperarse. La tasa de supervivencia varió según el operador desde 1 de 10 moscas hasta 2 de 3 moscas.

Se extrajeron tripas enteras de la mosca mediante disección con pinzas finas (Dumont). El tejido se fijó en PFA al 4% en PBS durante 3 h a 24 °C o a 4 °C durante la noche. Las tripas se permeabilizaron usando Triton-X al 0,1 % en PBS durante 30 min a temperatura ambiente, se lavaron dos veces en PBS, se tiñeron con 10 µg/ml de DAPI durante 30 min, se lavaron dos veces en PBS, se colocaron en medio de montaje durante hasta 1 h y luego transferido al portaobjetos utilizando una pipeta de 200 l de diámetro ancho. Luego se colocó cada intestino en un portaobjetos de vidrio cargado positivamente y se agregaron aproximadamente 60 µl de medio de montaje (medio de montaje: 80 % de glicerol, 20 % de Tris 9,0 0,1 M, 0,4 g/l de galato de N-propilo). Se añadieron de cinco a diez perlas de vidrio de 0,1 mm (Biospec) al medio de montaje para formar un espaciador que evita el aplastamiento de la muestra. Luego se cubrió el portaobjetos con un cubreobjetos del n.º 1,5 y se selló con esmalte de uñas.

La microscopía se realizó con un microscopio confocal Leica DMi8 utilizando un objetivo de inmersión en aceite HC Plan Apo de 40 × (1,30 NA) HC Plan Apo o un objetivo de inmersión en aceite de 60 × (1,40 NA) HC Plan Apo. Las líneas láser se generaron utilizando un láser de luz blanca con cristal AOTF y las longitudes de onda de excitación para los fluoróforos fueron: mGFP5, 488 nm; mCherry, 591 nm; Cy5, 650 nm. Se generaron imágenes intestinales completas agrupando múltiples capturas y luego fusionándolas usando la función Mosaic Merge en Leica Application Suite LAS X para unirlas en una sola pila. Las pilas en Z para tripas enteras tenían un grosor de 70 a 80 µm con cortes cada 0,5 µm o menos. Para representar imágenes bidimensionales para su publicación, los canales de fluorescencia se procesaron como proyecciones z de máxima intensidad y el canal de campo claro está representado por un único corte z desde el centro de la pila.

La distribución espacial de la colonización intestinal se cuantificó basándose en imágenes de microscopía utilizando FIJI para enmascarar y segmentar las regiones intestinales de las imágenes y MATLAB para cuantificar el alcance de la colonización. Primero, en FIJI, se generaron proyecciones z de intensidad sumada de secciones ópticas de 80 µm, luego se redimensionaron a una escala de 1 µm/px. Se aplicó la sustracción de fondo con un radio de bola rodante de 50 px. Se realizaron mediciones equivalentes en intestinos libres de gérmenes para cuantificar la autofluorescencia del intestino, que varía según la región.

A continuación, se dibujó a lo largo de la línea una línea segmentada usando un ajuste spline y un ancho variable de 40 a 200 µm dependiendo del ancho del intestino de la región en particular (p. ej., 200 µm para la parte ancha del cultivo y 40 µm para el proventrículo). longitud del intestino, comenzando con el punto más distal del buche como origen. La función "Perfil de parcela" se utilizó para medir la intensidad a lo largo de cada uno de los 11 segmentos: cultivo (2 segmentos), conducto del cultivo (2 segmentos), unión conducto del cultivo-proventrículo (1 segmento), proventrículo (1 segmento), intestino medio (3 segmentos) y el intestino posterior (2 segmentos). Estos perfiles de intensidad luego se exportaron a MATLAB.

En MATLAB, la longitud del segmento para cada región intestinal se calibró con la longitud promedio de cada segmento mediante un ajuste bilineal. Este paso dio como resultado que todos los intestinos estuvieran alineados y tuvieran el mismo tamaño general para que pudiéramos comparar la intensidad de cada región del intestino en los intestinos replicados. Luego, se restó el fondo del valor de cada valor de intensidad a lo largo de la línea y se normalizó a la intensidad de las bacterias confirmadas visualmente en esa región. Este paso se ajusta a la variación de la autofluorescencia a lo largo del intestino (más alta en el cultivo y el intestino posterior) y se ajusta a las diferencias en la intensidad de la fluorescencia de las bacterias debido a las diferentes profundidades del tejido. Después de este paso de normalización, se aplicó un filtro de promedio móvil de 100 µm dentro de los límites de cada región intestinal para suavizar la variación espacial a pequeña escala. Para convertir cada ubicación espacial a lo largo del intestino de la intensidad de la colonización a colonizada/no colonizada, establecimos un umbral de las intensidades de cada intestino según la inspección visual. Luego se trazó en los paneles de figuras la proporción de todos los intestinos con colonización en cada ubicación a lo largo del spline. Además, el número de intestinos con >5 % de colonización dentro de cada una de las regiones delineadas se informa como un porcentaje para cada una de las regiones de la siguiente manera: cultivo, conducto del cultivo, proventrículo, intestino medio, intestino posterior.

Para medir el desprendimiento de perlas de poliestireno (Spherotech FP-0552-2, azul cielo), se utilizó citometría de flujo para cuantificar el número de perlas gestadas. Las moscas se mantuvieron en tubos cónicos invertidos de 50 ml con 1 ml de alimento sólido en la tapa. Para recolectar el material desprendido, los tubos se enjuagaron con 10 ml de PBS, se agitaron durante 10 segundos y luego se colocó una tapa limpia encima. Para concentrar la solución, las muestras se centrifugaron en una centrífuga durante 7 minutos a 400 × g. Luego se resuspendió el sedimento en 200 µl de PBS. La muestra concentrada se contó en un citómetro de flujo Attune (Thermo Fisher).

Se diseccionaron intestinos enteros en tampón Cacodilato pH 7,4 (Cac), luego se fijaron durante 2 días en GA al 3% + FA al 1% en Cac 0,1 M a 4 °C. Las muestras se incluyeron en agarosa y se almacenaron a 4 °C hasta su posterior procesamiento. Luego, las muestras se lavaron en tampón Cac, se tiñeron con OsO4 al 1 % + KfeCN al 1,25 % durante 1 h, se lavaron en agua, se trataron con maleato 0,05 M, pH 6,5 (Mal), se tiñeron con acetato de uranilo al 0,5 % en Mal durante 1,25 h y luego se lavaron. con concentraciones crecientes de etanol. Para la inclusión en resina, las muestras se trataron con resina + óxido de propileno (1:1) se evaporaron durante la noche como disolvente de transición antes de la inclusión, luego se incluyeron en resina epoxi (Epon+Quetol (2:1)+Spurr (3:1)+ BDMA al 2% durante la noche a 55 °C y curado a 70 °C durante 4 días.

Las muestras se prepararon para XR µCT siguiendo el protocolo de la ref. 51, que los autores compartieron generosamente antes de su publicación. Brevemente, las moscas se lavaron en Triton-X al 1% en PBS para reducir la cera cuticular. Se hizo un agujero poco profundo en el abdomen y el tórax con un fino alfiler de tungsteno para aumentar la permeación del fijador y el tinte. La fijación fue con la solución de Bouin. La tinción se realizó con ácido fosfotúngstico durante 3 semanas. Las moscas se montaron para obtener imágenes en una punta de micropipeta de 10 µl que contenía agua desionizada y se sellaron con parafilm. Las imágenes se realizaron en la fuente de luz avanzada de sincrotrón del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley en la línea de luz 8.3.2 con la ayuda de Dula Parkinson. Se adquirieron 1313 imágenes por muestra con un aumento de 20 aumentos y 180 grados de rotación. Las retroproyecciones se realizaron utilizando Tomopy con las siguientes especificaciones:

doFWringremoval 0 doPhaseRetrieval 1 alphaReg 0.5 doPolarRing 1 Rmaxwidth 30 Rtmax 300

Más especificaciones están disponibles aquí: http://microct.lbl.gov/. Las imágenes de la Fig. 4A, B se produjeron en Octopus 8.8.2.7 y VG Studio 2.2. Las reconstrucciones volumétricas de la luz intestinal en las figuras 4D-G se realizaron en Imaris mediante segmentación manual.

Para incrustar moscas en OCT (McKessen, 981385), primero se quitaron las patas y las alas. A continuación, las moscas se equilibraron con el medio OCT sumergiéndolas y agitándolas para eliminar las burbujas. Luego, las moscas se transfirieron a OCT fresco en Cryomold (Ted Pella Inc., 4565, lote 78652). Se orientaron hasta 5 moscas en paralelo en un solo molde. El bloque se congeló rápidamente colocándolo sobre un lecho de hielo seco en polvo y luego se almacenó a -80 °C hasta su corte. Se prepararon secciones de 10 µm a -24 °C utilizando un criostato Leica CM3050 y se transfirieron a portaobjetos cargados positivamente (VWR Superfrost Plus, 48311-703). Las secciones se secaron al aire usando un Mini Dry Bath (USA Scientific, BSH200) y luego se almacenaron a -20 °C hasta la tinción.

Las secciones se fijaron y teñiron dentro de los 2 días posteriores a la sección. Primero, se eliminó el exceso de OCT de los portaobjetos lavándolos brevemente en HBSS (Protocolo Cold Harbor Springs). A continuación, las secciones se fijaron en PFA al 4% durante 30 minutos y luego se lavaron una vez en HBSS. Antes de la tinción, las secciones se bloquearon usando BSA al 1% en HBSS. Las secciones se tiñeron durante 30 min con la lectina específica en su concentración óptima: (12,5 µg/mL de aglutinina de germen de trigo (WGA – Biotium, 29026-1, lote 18W1205), 50 µg/mL de aglutinina de Dolichos biflorus (DBA – Glycomatrix, 21511013- 1, lote L20092804ZH), 50 µg/mL de aglutinina culinarus de la lente (LCA – Glycomatrix, 21511020-1, lote L20092902ZH), o 50 µg/mL de succinilado WGA (S-WGA – Vectorlabs, FL-1021S-5, lote 2008145) La tinción con lectina se realizó simultáneamente con la contratinción Calcofluor (Sigma-Aldrich, 910090, lote MKCL1227) en HBSS. Luego, las secciones se lavaron una vez en HBSS y una vez más en HBSS al 10%. Las secciones se montaron en medio de montaje (glicerol al 80%, 20 % Tris 0,1 M pH 9,0) y se cubrió con un cubreobjetos #1.

La concentración óptima para la tinción de cada lectina se determinó preparando concentraciones de 50 µg/mL, 12,5 µg/mL y 3 µg/mL en presencia del azúcar hapténico específico a una concentración de 500 mM. Para WGA y S-WGA, el azúcar hapténico fue N-acetilglucosamina (Vectorlabs, S-9002, lote ZJ022). Para DBA, el azúcar hapténico fue N-acetilgalactosamina (Vectorlabs, S-9001, lote ZJ0301). Para LCA, el azúcar hapténico fue D-manosa (Sigma, M602025G, lote SLBG0980V). La especificidad de cada lectina se evaluó mediante la inhibición de la tinción por el azúcar hapténico. La concentración más baja de lectina que tiñó el tejido y pudo ser inhibida por su correspondiente azúcar hapténico se eligió como concentración óptima y se utilizó para procedimientos posteriores.

Las pruebas estadísticas se realizaron en Prism. En general, se verificó la normalidad de los datos mediante una prueba de Shapiro-Wilk. Si se establecía normalidad, se realizaba la prueba t de Welch. Se realizaron pruebas estadísticas de abundancia de UFC en datos transformados en log10. Cuando las UFC eran 0, el registro se establecía en 0 (correspondiente a un pseudoconteo de 1). Cuando se realizaron comparaciones múltiples, se realizó un ANOVA unidireccional ordinario. Si eran significativas, se realizaron comparaciones múltiples por pares con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Cuando los datos no se distribuyeron normalmente, las comparaciones se realizaron mediante pruebas de orden de clasificación de Wilcoxon. Las barras de error en proporciones son el error estándar de la proporción (sep) o intervalos de confianza binomiales del 95% utilizando el método de Clopper-Pearson o el método de Jeffries, como se especifica en el texto. La significación estadística de las diferencias en proporciones se evaluó mediante una prueba Z.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementarios). Los datos originales se proporcionan con este documento.

Durack, J. & Lynch, SV El microbioma intestinal: relaciones con la enfermedad y oportunidades de terapia. J. Exp. Medicina. 216, 20–40 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baumgartner, M. y col. Las biopelículas mucosas son una característica endoscópica del síndrome del intestino irritable y la colitis ulcerosa. Gastroenterología 161, 1245–1256.e20 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lee, J. y col. Trasplantes de microbiota jóvenes versus ancianos a ratones libres de gérmenes: aumento de los ácidos grasos de cadena corta y mejora del rendimiento cognitivo. Microbios intestinales 12, 1-14 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Fisher, CK y Mehta, P. Identificación de especies clave en el microbioma intestinal humano a partir de series temporales metagenómicas mediante regresión lineal dispersa. PLoS One 9, e102451 (2014).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Subramanian, S. y col. Inmadurez persistente de la microbiota intestinal en niños de Bangladesh desnutridos. Naturaleza 510, 417–421 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ng, KM y cols. Los azúcares del huésped liberados por la microbiota facilitan la expansión post-antibiótica de los patógenos entéricos. Naturaleza 502, 96–99 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dethlefsen, L. & Relman, DA Recuperación incompleta y respuestas individualizadas de la microbiota intestinal distal humana a la perturbación repetida de los antibióticos. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. EE.UU. 108, 4554–4561 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Lawley, TD y Walker, AW Resistencia a la colonización intestinal. Inmunología 138, 1-11 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Muscariello, L., De Siena, B. & Marasco, R. Proteínas de la superficie celular de Lactobacillus implicadas en la interacción con el moco y los componentes de la matriz extracelular. actual. Microbiol. 77, 3831–3841 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Frese, SA et al. Caracterización molecular de la formación de biopelículas específicas del huésped en un simbionte intestinal de vertebrados. PLoS Genet. 9, e1004057 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sender, R., Fuchs, S. y Milo, R. Estimaciones revisadas del número de células humanas y bacterianas en el cuerpo. PLoS Biol. 14, e1002533 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Fe, JJ et al. La estabilidad a largo plazo de la microbiota intestinal humana. Ciencia 341, 1237439 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sonnenburg, ED y cols. Las extinciones inducidas por la dieta en la microbiota intestinal se combinan a lo largo de generaciones. Naturaleza 529, 212-215 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rothschild, D. y otros. El medio ambiente domina sobre la genética del huésped en la configuración de la microbiota intestinal humana. Naturaleza 555, 210–215 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

David, LA y cols. La dieta altera de forma rápida y reproducible el microbioma intestinal humano. Naturaleza 505, 1–18 (2013).

Caporaso, JG et al. Imágenes en movimiento del microbioma humano. Genoma Biol. 12, R50 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, JK y cols. Comprensión de la regulación de la población de simbiontes intestinales mediada por el huésped y la inmunidad del huésped mediada por simbiontes en el sistema de simbiosis Riptortus-Burkholderia. Desarrollo. comp. Inmunol. 64, 75–81 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Kikuchi, Y., Ohbayashi, T., Jang, S. & Mergaert, P. Burkholderia insecticola desencadena el cierre del intestino medio en la chinche Riptortus pedestris para prevenir infecciones bacterianas secundarias de las criptas del intestino medio. ISME J. 14, 1-12 (2020).

McFall-Ngai, MJ La importancia de los microbios en el desarrollo animal: lecciones de la simbiosis calamar-vibrio. Año. Rev. Microbiol. 68, 177-194 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fung, C. y col. El mapeo de alta resolución revela que los micronichos en las glándulas gástricas controlan la colonización del estómago por Helicobacter pylori. PLoS Biol. 17, 1-28 (2019).

Artículo de Google Scholar

Lee, SM y cols. Los factores de colonización bacteriana controlan la especificidad y la estabilidad de la microbiota intestinal. Naturaleza 501, 426–429 (2014).

ADS del artículo Google Scholar

Saffarian, A. y col. Microbiotas centrales asociadas a criptas y mucosas en humanos y su alteración en pacientes con cáncer de colon. mBio 10, G351–20 (2019).

Artículo de Google Scholar

Douglas, AE El modelo de Drosophila para la investigación del microbioma. Animación de laboratorio. 47, 157-164 (2018).

Artículo de Google Scholar

Obadía, B. et al. La invasión probabilística subyace a la estabilidad natural del microbioma intestinal. actual. Biol. 27, 1999–2006.e8 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Broderick, NA y Lemaitre, B. Microbios asociados al intestino de Drosophila melanogaster. Microbios intestinales 3, 307–321 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wong, CNA, Ng, P. & Douglas, AE Comunidad bacteriana de baja diversidad en el intestino de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Reinar. Microbiol. 13, 1889-1900 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ludington, WB & Ja, WW Drosophila como modelo para el microbioma intestinal. Patógeno PLoS. 16, e1008398 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Douglas, AE Modelos animales simples para la investigación del microbioma. Nat. Rev. Microbiol. 17, 1-12 (2019).

Walters, AW y cols. La microbiota influye en la estrategia de historia de vida de Drosophila melanogaster. Mol. Ecológico. 29, 639–653 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, H.-Y., Lee, S.-H., Lee, J.-H., Lee, W.-J. y Min, K.-J. El papel de los microbios comensales en la vida útil de Drosophila melanogaster. Envejecimiento (Albany NY). 11, 4611–4640 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Téfit, MA & Leulier, F. Lactobacillus plantarum favorece la aparición temprana de Drosophila adulta en forma y fértil en caso de desnutrición crónica. J. Exp. Biol. 220, 900–907 (2017).

PubMed PubMed Central Google Académico

Consuegra, J. et al. La cooperación metabólica entre bacterias comensales apoya el crecimiento juvenil de Drosophila bajo estrés nutricional. iCiencia 23, 101232 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Henriques, SF et al. La alimentación cruzada metabólica en dietas desequilibradas permite que los microbios intestinales mejoren la reproducción y alteren el comportamiento del huésped. Nat. Comunitario. 11, 4236 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gould, AL y cols. Las interacciones del microbioma dan forma a la aptitud del huésped. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. EE.UU. 115, E11951–E11960 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eble, H., Joswig, M., Lamberti, L. y Ludington, WB Particiones de grupos y paisajes de aptitud del microbioma de la mosca Drosophila. J. Matemáticas. Biol. 79, 861–899 (2019).

Artículo MathSciNet PubMed PubMed Central MATH Google Scholar

Pais, IS, Valente, RS, Sporniak, M. & Teixeira, L. Drosophila melanogaster establece una interacción mutualista específica de la especie con bacterias estables colonizadoras del intestino. PLoS Biol. 16, e2005710 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Storelli, G. y col. Drosophila perpetúa el mutualismo nutricional al promover la aptitud de su simbionte intestinal Lactobacillus plantarum. Metabolismo celular. 27, 1-16 (2018).

Artículo de Google Scholar

King, DG Organización celular y formación de membrana peritrófica en el cardias (proventrículo) de Drosophila melanogaster. J. Morfol. 196, 253–282 (1988).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Marianes, A. & Spradling, AC Compartimentación fisiológica y de células madre dentro del intestino medio de Drosophila. Elife 2, e00886–e00886 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Brien, LE, Soliman, SS, Li, X. y Bilder, D. Los modos alterados de división de células madre impulsan el crecimiento intestinal adaptativo. Celda 147, 603–614 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Obniski, R., Sieber, M. & Spradling, AC Los lípidos dietéticos modulan la señalización de muesca e influyen en el desarrollo intestinal y el metabolismo de los adultos en Drosophila. Desarrollo. Celda 47, 98–111.e5 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tilman, D. Competencia y biodiversidad en hábitats espacialmente estructurados. Ecología 75, 2-16 (1994).

Artículo de Google Scholar

Peay, KG, Belisle, M. & Fukami, T. La relación filogenética predice efectos prioritarios en las comunidades de levadura néctar. Proc. R. Soc. B Biol. Ciencia. 279, 749–758 (2011).

Amor, DR, Ratzke, C. & Gore, J. Los invasores transitorios pueden inducir cambios entre estados estables alternativos de comunidades microbianas. Ciencia. Adv. 6, 1–9 (2020).

Artículo de Google Scholar

Friedman, J., Higgins, LM y Gore, J. La estructura comunitaria sigue reglas de ensamblaje simples en microcosmos microbianos. Nat. Publ. Gramo. 1, 1–7 (2017).

Google Académico

Martínez, I., Maldonado-Gomez, MX & Gomes-Neto, JC Evaluación experimental de la importancia de la historia de la colonización en el ensamblaje de la microbiota intestinal en las primeras etapas de la vida. Elife 7, e36521 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Maldonado-Gómez, MX et al. El injerto estable de Bifidobacterium longum AH1206 en el intestino humano depende de las características individualizadas del microbioma residente. CHOM 20, 515–526 (2016).

Google Académico

Pitiwittayakul, N., Yukphan, P., Chaipitakchonlatarn, W., Yamada, Y. y Theeragool, G. Acetobacter thailandicus sp. nov., para una cepa aislada en Tailandia. Ana. Microbiol. 65, 1855–1863 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Sannino, DR, Dobson, AJ, Edwards, K, Angert, ER y Buchon, N. La microbiota intestinal de Drosophila melanogaster suministra tiamina a su huésped. mBio 9, e00155–18 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mattei, AL, Riccio, ML, Avila, FW y Wolfner, MF Vista 3D integrada de las respuestas posteriores al apareamiento del tracto reproductivo femenino de Drosophila melanogaster, obtenida mediante tomografía microcomputada. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 112, 8475–8480 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schoborg, TA, Smith, SL, Smith, LN, Douglas Morris, H. y Rusan, NM La tomografía microcomputarizada como plataforma para explorar el desarrollo de Drosophila. Desarrollo 146, dev176685 (2019).

CAS Google Académico

Buchon, N. y col. Caracterización morfológica y molecular de la compartimentación del intestino medio en adultos en Drosophila. Representante de celda 3, 1725-1738 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Johansson, MEV, Sjövall, H. & Hansson, GC El sistema moco gastrointestinal en la salud y la enfermedad. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10, 352–361 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monsigny, M., Roche, A. -C., Sene, C., Maget-Dana, R. y Delmotte, F. Interacciones azúcar-lectina: ¿cómo se une la aglutinina de germen de trigo a los sialoglicoconjugados? EUR. J. Bioquímica. 104, 147-153 (1980).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Roth, J. y col. Aparición de ácidos siálicos en Drosophila melanogaster. Ciencia 256, 673–675 (1992).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Sommer, AJ y Newell, PD Base metabólica del mutualismo entre las bacterias intestinales y su impacto en el huésped Drosophila melanogaster. Aplica. Reinar. Microbiol. 85, e01882–18 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Syed, ZA, Härd, T., Uv, A. & van Dijk-Härd, IF Un papel potencial de las mucinas de Drosophila en el desarrollo y la fisiología. PLoS One 3, e3041 (2008).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, Y., Li, L. & Rong, YS JiangShi: una proteína similar a la mucina ampliamente distribuida, esencial para el desarrollo de Drosophila. G3: Genes, Genomas, Genética. 12, jkac126 (2022).

Altmann, GG Observaciones morfológicas sobre células no caliciformes secretoras de moco en las criptas profundas del colon ascendente de rata. Soy. J. Anat. 167, 95-117 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Aranda-Díaz, A. et al. Las interacciones bacterianas entre especies modulan la tolerancia a los antibióticos mediada por el pH. Elife 9, e51493 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Blum, JE, Fischer, CN, Miles, J. & Handelsman, J. La reposición frecuente sostiene el microbioma beneficioso de Drosophila melanogaster. mBio 4, e00860–13 (2013). e00860-13.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Keebaugh, ES, Yamada, R., Obadia, B., Ludington, WB & Ja, WW La cantidad microbiana afecta la nutrición, el desarrollo y la esperanza de vida de Drosophila. iScience 4, 247–259 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, AF y Benzer, S. Mejora de la vida útil de Drosophila mediante bacterias exógenas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 101, 12974–12979 (2004).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spath, K., Heinl, S., Egger, E. & Grabherr, R. Lactobacillus plantarum y Lactobacillus buchneri como sistemas de expresión: evaluación de diferentes orígenes de replicación para el diseño de vectores lanzadera adecuados. Mol. Biotecnología. 52, 40–48 (2011).

Artículo de Google Scholar

Dobson, ETA et al. ImageJ y CellProfiler: complementos en el análisis de bioimágenes de código abierto. actual. Protocolo. 1, 1-19 (2021).

Artículo de Google Scholar

Marx, CJ y Lidstrom, ME Desarrollo de vectores mejorados y versátiles de amplio rango de huéspedes para su uso en metilotrofos y otras bacterias gramnegativas. Microbiología 147, 2065–2075 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

Reingard Grabherr de BOKU, Austria, proporcionó generosamente el plásmido pCD256-mCherry64. El plásmido pCM6266 fue generosamente proporcionado por Elizabeth Skovran de la Universidad Estatal de San José, EE.UU. KCH es un investigador del Biohub Chan-Zuckerberg. La financiación fue proporcionada por Banting y el Instituto del Pacífico para las becas postdoctorales de Ciencias Matemáticas para EWJ, una beca de investigación para estudiantes internacionales del Instituto Médico Howard Hughes, una beca Stanford Bio-X Bowes y el programa Siebel Scholars para AA-D, el Allen Discovery Center. en Stanford sobre Modelado de sistemas de infección para KCH, la Fundación David y Lucile Packard y el Instituto de Biotecnologías Colaborativas a través de la subvención W911NF-09-0001 de la Oficina de Investigación del Ejército de EE. UU. para JMC, una subvención de descubrimiento del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá y el programa de Cátedras de Investigación de Canadá al DAS, el Instituto Médico Howard Hughes a ACS y CW, los Institutos Nacionales de Salud otorgan DP5OD017851 y R01DK128454 a WBL, la Fundación Nacional de Ciencias otorga IOS 2032985 a WBL y KCH, la Fundación Nacional de Ciencias otorga IOS 2144342 a WBL, el Carnegie Institution for Science Endowment para WBL y ACS, una subvención de la Carnegie Institution of Canada para WBL y DAS, y una subvención de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud T32GM007231 para KA. El trabajo de ELB y MV fue apoyado por el Programa de Investigación y Desarrollo Dirigido por Laboratorio del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley bajo el contrato No. DE-AC02-05CH11231 del Departamento de Energía de EE. UU.

Departamento de Embriología, Carnegie Institution for Science, Baltimore, MD, 21218, EE. UU.

Ren Dodge, Haolong Zhu, Daniel J. Martínez, Chenhui Wang, Kevin Aumiller, Allan C. Spradling y William B. Ludington

Departamento de Física, Universidad Simon Fraser, Burnaby, BC, V5A 1S6, Canadá

Eric W. Jones y David A. Sivak

Departamento de Física, Universidad de California, Santa Bárbara, CA, 93106, EE. UU.

Eric W. Jones y Jean M. Carlson

Departamento de Biología, Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21218, EE. UU.

Haolong Zhu, Kevin Aumiller, Zhexian Liu, Allan C. Spradling y William B. Ludington

Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de California, Berkeley, CA, 94720, EE. UU.

Benjamín Obadías

Instituto Médico Howard Hughes, Baltimore, MD, 21218, EE. UU.

Chenhui Wang y Allan C. Spradling

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Andrew Aranda-Díaz y Kerwyn Casey Huang

Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, Berkeley, CA, 94720, EE. UU.

Marco Voltolini y Eoin L. Brodie

Departamento de Ciencias de la Tierra, Universidad de Milán, Milán, Italia

Marco Voltolini

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, 94305, EE. UU.

Kerwyn Casey Huang

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, 94158, EE. UU.

Kerwyn Casey Huang

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

RD, EWJ, HZ, BO, CW, EB, JMC, DAS, AS y WBL diseñaron la investigación. RD, EWJ, HZ, BO, CW, KA, AA-D., MV y WBL realizaron la investigación. RD, EWJ, DJM y WBL analizaron los datos. RD y WBL escribieron el manuscrito. RD, EWJ, KCH, DAS, JMC, ACS y WBL revisaron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito antes de enviarlo.

Correspondencia a William B. Ludington.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a François Leulier y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Dodge, R., Jones, EW, Zhu, H. et al. Un nicho físico simbiótico en Drosophila melanogaster regula la asociación estable de una microbiota intestinal de múltiples especies. Nat Commun 14, 1557 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36942-x

Descargar cita

Recibido: 11 de enero de 2022

Aceptado: 22 de febrero de 2023

Publicado: 21 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36942-x

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Comunicaciones ISME (2023)

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.