Ácidos borónicos alternativos en la detección de Micolactona A/B mediante cromatografía en capa fina (f

BMC Infectious Diseases volumen 23, número de artículo: 495 (2023) Citar este artículo

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Mycobacterium ulcerans es el agente causante de la úlcera de Buruli. La patología de la enfermedad de M. ulcerans se ha atribuido a la secreción de una potente citotoxina macrólida conocida como micolactona, que desempeña un papel importante en la virulencia de la enfermedad. La micolactona es un biomarcador para el diagnóstico de UB que se puede detectar mediante la técnica de cromatografía en capa fina fluorescente (f-TLC). La técnica se basa en la derivatización química de la micolactona A/B con ácido 2-naftilborónico (BA), que actúa como un quimiosensor fluorogénico. Sin embargo, las interferencias de fondo debidas a los lípidos del tejido humano extraídos conjuntamente, especialmente con muestras clínicas, junto con la subjetividad del método, exigen una investigación para encontrar una alternativa al BA.

Inicialmente se seleccionaron veintiséis ácidos arilborónicos disponibles comercialmente como alternativas al BA mediante el experimento f-TLC. También se realizaron mediciones UV-vis para determinar los espectros de absorción máxima de la micolactona A/B y los aductos de ácido micoborónico, seguidas de una investigación de la capacidad de mejora de la fluorescencia de la formación de éster de boronato entre la micolactona A/B y nuestros tres borónicos más prometedores. ácidos (BA15, BA18 y BA21). Se empleó la técnica LC-MS para confirmar la formación de aductos entre la micolactona y los ácidos borónicos. Además, se realizó un estudio comparativo entre BA18 y BA utilizando 6 muestras de pacientes con BU confirmadas por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Tres de los ácidos borónicos (BA15, BA18 y BA21) produjeron intensidades de bandas fluorescentes superiores a BA. Los estudios de complejación realizados por cromatografía en capa fina (TLC) utilizando una solución 0,1 M de los tres ácidos borónicos y varios volúmenes de 10 ng/μL de micolactona sintética que van desde 1 μL – 9 μL correspondientes a 10 ng – 90 ng dieron resultados similares con mico- Aducto BA18 emergiendo con las bandas de fluorescencia más visiblemente intensas. Los máximos de absorción UV-vis (λmax) para la micolactona A/B libre se observaron a 362 nm, y los valores para los aductos myco-BA15, myco-BA18 y myco-BA21 fueron a 272 nm, 270 nm y 286 nm. respectivamente. El λmax experimental comparable de 362 nm para la micolactona A/B con el valor calculado de Woodward-Fieser de 367 nm para la cadena lateral de ácido graso de la micolactona A/B demuestra que, aunque se formaron 2 boronatos cíclicos, sólo el boronato del lado sur La cadena con el cromóforo se excitó mediante irradiación a 365 nm. Los experimentos de fluorescencia han demostrado que el acoplamiento de BA18 a la micolactona A/B a lo largo de los 1,3-dioles mejoró notablemente la intensidad de la fluorescencia a 537 nm. Se utilizó un espectrómetro de masas de alta resolución (HR-MS) para confirmar la formación del aducto mico-BA15. Finalmente, el análisis f-TLC de muestras de pacientes con BA18 proporcionó intensidades del aducto de BA18 mejoradas en comparación con el aducto de BA original.

Se investigaron veintiséis ácidos borónicos disponibles comercialmente como alternativas al BA, utilizados en el análisis f-TLC para el diagnóstico de BU. Tres (3) de ellos, BA15, BA18 y BA21, dieron perfiles de intensidad de banda de fluorescencia superiores. Dieron perfiles que eran más fáciles de interpretar después de la formación del aducto de ácido micoborónico y en experimentos con muestras clínicas de pacientes con BA18 los mejores. Por lo tanto, BA18 ha sido identificado como una alternativa potencial a BA y podría proporcionar una solución al desafío de la interferencia de fondo de los lípidos de tejido humano coextraídos de muestras clínicas actualmente asociadas con el uso de BA.

Informes de revisión por pares

La micolactona (ML), la primera citotoxina macrólida que se sabe es producida por un patógeno humano, Mycobacterium ulcerans (MU), es el agente causante de la úlcera de Buruli (BU) [1, 2]. Es el único macrólido identificado en el género Mycobacterium [3]. En 1965, Connor y sus colaboradores plantearon la hipótesis de que M. ulcerans era responsable de la producción de la citotoxina difusible, lo que posteriormente se confirmó utilizando conejillos de indias. La inyección de filtrados de cultivos de micobacterias en animales de experimentación provocó una necrosis similar a la de las infecciones humanas [4,5,6]. Posteriormente, la molécula sospechosa fue aislada, purificada y caracterizada efectivamente a partir de la porción soluble en acetona de extractos lipídicos de M. ulcerans en 1999 por George et al. Posteriormente, la estructura química se resolvió como un policétido denominado micolactona (ML) [7, 8]. ML se detectó en cromatografía de capa fina (TLC) como una banda lipídica activa ultravioleta de color amarillo claro con un valor de factor de retención de 0,23 en cloroformo/metanol/agua (90:10:1, vol/vol/vol) [7]. Se observó un pico prominente a m/z 765, correspondiente al aducto de sodio de la micolactona, mediante análisis de espectrometría de masas (MS) en condiciones de electropulverización. ML es un macrólido policétido híbrido con un anillo de lactona de 12 miembros en su núcleo, junto con una cadena lateral de acilo poliinsaturado ligada a C5-O numerada C1′-C16′ hacia el sur y una cadena lateral superior ligada a C formada por átomos de carbono C12-C20. Los diferentes congéneres de micolactona resultan de diferencias en la cadena "Sur", mientras que la cadena "Norte" superior es invariante. Investigaciones adicionales revelaron que la micolactona obtenida de M. ulcerans era una combinación 3:2 de los dos estereoisómeros conocidos como micolactonas A y B, que se forman como isómeros geométricos espontáneos alrededor del doble enlace en C4′ C5′ (mostrado por la línea ondulada entre C5′ y C6′) [9, 10] (Fig. 1).

Estructura de la micolactona A/B. La micolactona A/B tiene un anillo central de lactona cíclica (C1-C11) y dos cadenas laterales de acilo altamente insaturadas producidas a partir de policétidos. La cadena "sur" más larga está numerada como C1′-C16′, y la cadena "norte" superior está formada por C12-C20. La micolactona existe como una proporción de 3:2 de isómeros geométricos que se generan espontáneamente alrededor del doble enlace en C4′ C5′ (representado por la línea ondulada entre C5′ y C6′).

La patología de la enfermedad de M. ulcerans se ha atribuido en gran medida a la secreción de esta potente citotoxina, una sustancia crucial para la patogenicidad de la enfermedad [7]. Varios informes han atribuido a la toxina propiedades de necrosis tisular, indolora y inmunosupresoras [11, 12]. La micolactona A/B se difunde fuera de los sitios de la infección original, por lo que es un objetivo interesante para la detección en las células sanguíneas circulantes [13].

Dado que la toxina sólo la produce M. ulcerans, se está investigando la micolactona como biomarcador para el diagnóstico de la úlcera de Buruli. Se han desarrollado métodos que incluyen cromatografía en capa fina (TLC) [7, 8], espectrometría de masas [14,15,16] o ensayos de citotoxicidad [15] para detectar y cuantificar micolactona en muestras de tejido con vistas al diagnóstico de la enfermedad de BU. La micolactona se ha investigado recientemente en muestras de biopsia de pacientes mediante LC-MS [15, 17] y unión a aptámero de ARN [18].

Con fines de diagnóstico, Kishi y sus colegas desarrollaron un método de cromatografía en capa fina fluorescente (f-TLC) muy sensible, práctico, relativamente económico y fácil de usar para la detección de micolactonas producidas por el patógeno humano Mycobacterium ulcerans [19 ]. En el método, la micolactona A/B se derivatizó químicamente utilizando ácido 2-naftilborónico (BA) como quimiosensor fluorogénico (Fig. 2). Las unidades de 1,3-diol en las cadenas laterales de la micolactona A/B forman un complejo con el ácido borónico para generar dos anillos de boronato cíclicos de 6 miembros. Cuando el cromóforo de pentanoato en la cadena lateral sur se irradió a una longitud de onda de 365 nm, se observó una emisión de fluorescencia mejorada del boronato cíclico C13', C15' a una longitud de onda de emisión del cromóforo de 520 nm [19] (Fig. 2).

Ilustración esquemática del método de detección de TLC fluorescente que muestra la derivatización de micolactona A/B con BA [19]

Los ácidos borónicos se han acoplado previamente con cis-1,2- y 1,3-dioles para generar ésteres de boronato cíclicos reversibles de cinco o seis miembros [20,21,22,23]. La fluorescencia puede verse muy afectada por la formación de ésteres de borato. El primer informe sobre el uso del ácido borónico como receptor para la detección de sacáridos fue realizado en 1992 por Yoon y Czarnik [24]. Desde entonces, numerosas aplicaciones biomédicas han utilizado las distintas propiedades de reconocimiento de los ácidos borónicos y sus análogos contra los 1,2 o 1,3 dioles [25]. En el área de la medicina de diagnóstico, los sensores desempeñan un papel crucial en su capacidad para proporcionar una resolución rápida y cuantitativa de los analitos. Whyte y sus colaboradores demostraron que los ácidos borónicos son sensores confiables para una variedad de sacáridos, polisacáridos, glicoproteínas, proteínas glucosiladas y dopamina [25].

Además, se han desarrollado sensores de ácido borónico para medir los niveles de glucosa en sangre [26,27,28,29,30], compuestos iónicos [31,32,33], trazas de agua en disolventes [34, 35], peróxido de hidrógeno (H2O2) [36, 37] y catecolaminas [38]. Los ácidos borónicos también se han empleado como herramientas bioquímicas para una variedad de aplicaciones, incluidas imágenes de células tumorales [39, 40], inhibidores de enzimas [41] y métodos de administración de células [42]. Por estos motivos, los sensores de fluorescencia basados en boro son cruciales en la investigación actual.

Se ha demostrado con éxito la detección de micolactona mediante acoplamiento a BA [19, 43,44,45]. Sin embargo, es necesario abordar preocupaciones como las interferencias de fondo de los lípidos del tejido humano extraídos conjuntamente. Es necesaria la búsqueda de un ácido borónico más eficiente y fluorescente como alternativa al BA original utilizado por Kishi y sus compañeros. Para encontrar posibles alternativas al BA, se seleccionaron varios ácidos arilborónicos disponibles comercialmente utilizando f-TLC. Se realizó la cromatografía en capa fina (TLC) de los ácidos borónicos adquiridos y se comparó el perfil de las intensidades de sus bandas de fluorescencia con el BA.

La micolactona sintética A/B fue amablemente donada por el profesor Kishi Yoshito (Universidad de Harvard) a través de la Organización Mundial de la Salud (OMS), Ginebra, Suiza. Los veintiséis ácidos arilborónicos estructuralmente diversos se adquirieron en Sigma-Aldrich. Todos los reactivos eran de calidad analítica y se utilizaron sin purificación adicional. Los disolventes son de calidad comercial y se utilizaron tal como se suministran. Se adquirieron 60 placas de gel de sílice TLC sin colorantes fluorescentes (5721–7) de EMD Chemical Inc y se cortaron en tamaños de 5 × 2 cm para el desarrollo de la placa. La lámpara UV utilizada fue un transiluminador UV de sobremesa (lámpara UV UVLM-28 EL Series de 365/302 nm (8 vatios) adquirida de UVP Inc.

Se prepararon soluciones de 0,1 M de diversos ácidos arilborónicos estructuralmente diversos mediante la adición de acetona y se utilizaron de acuerdo con el informe anterior de Kishi y colaboradores [19]. La solución estándar de micolactona A/B para manchado por TLC se preparó a partir de una solución madre de 0,1 mg/ml de micolactona en 0,5 ml en una ampolla. Se preparó una solución estándar de 10 ng/μL de micolactona A/B tomando 0,1 ml de la solución madre de micolactona en un vial de vidrio y añadiendo 0,9 ml de acetato de etilo para obtener el estándar requerido. La visualización óptima de la micolactona A/B se logró colocando el estándar en las placas de CCF de vidrio recubiertas de sílice, eluyendo con una mezcla de cloroformo/hexano/metanol (5:4:1; v/v/v) y finalmente, mediante cámara lenta. inmersión de la placa eluida en las soluciones de ácido borónico 0,1 M, extracción y luego calentamiento de la placa a una temperatura de ~ 100 °C. Luego se limpió el lado de vidrio de la placa con una toalla de papel tisú empapada en acetona y luego se observó iluminando a ~ 365 nm usando un transiluminador UV de mesa.

Los espectros de absorción se registraron en un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800. Todos los espectros de absorción UV-Vis se obtuvieron utilizando cubetas de cuarzo con un diámetro de 1 cm entre 200 y 800 nm.

Los experimentos fluorométricos se realizaron tanto en un espectrofluorómetro Shimadzu (modelo RF-6000) como en un espectrofluorómetro Horiba Jobin Yvon (HJY) Fluoromax-3. Los espectros de emisión se registraron a temperatura ambiente con una longitud de onda de excitación de 365 nm y anchos de rendija de excitación y emisión establecidos en 5 nm y 10 nm respectivamente. Se prepararon varias diluciones de micolactona A/B (4 a 32 µg/ml) a partir de una solución estándar de micolactona A/B (0,1 mg/ml en 0,5 ml de EtOAc) como se muestra en la Tabla 1 a continuación en viales de color ámbar de 4 ml. Se diluyeron usando ciclohexano para obtener las concentraciones finales.

Soluciones de ácidos borónicos ácido 2-naftilborónico (BA), ácido [1,1':4',1''-terfenil]-2-ilborónico (BA15), (9,9-difenil-9H-fluoren-4-ilo También se prepararon ácido )borónico (BA18) y ácido (3-(naftalen-1-il)fenil)borónico (BA21) (0,10 M) en metanol. Para realizar reacciones de 1 ml, se dispensaron siete muestras que contenían 500 µL de solución BA18 0,10 M y 500 µL de cada dilución de la solución estándar de micolactona A/B (4 a 32 µg/mL) en la Tabla 1 en microtubos de 1,5 ml y se mezclaron bien. y los espectros de fluorescencia se registraron después de 10 min (λex 365 nm y λem de 380 a 700 nm).

A una solución de diol (1 equiv.) en diclorometano (DCM) (1 M) se le añadió ácido borónico (1 equiv.). La mezcla resultante se agitó durante 30 min. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo resultante se secó a alto vacío (0,1 mm Hg) durante 1 h. Luego se volvió a disolver en ciclohexano y se usó como solución madre para el análisis de espectrometría de masas (Fig. 3).

Reacción de 1,3-diol con ácido arilborónico para formar un éster de boronato cíclico de 6 miembros

Los análisis se llevaron a cabo utilizando un LC 1260 Infinity (Agilent Technologies), acoplado a un espectrómetro de masas en tándem de tiempo de vuelo cuadrupolo 6530 Infinity Q-ToF (Agilent Technologies) mediante una interfaz Jet Stream ESI (Agilent Technologies). Las condiciones de LC fueron: columna Zorbax Extend-C18 (2,1 mm ⨯ 50 mm, tamaño de partícula de 1,8 μm); caudal de 0,4 ml/min; Volumen de inyección de 1 μl para experimentos de EM. y 10 µL para experimentos de MSMS; Temperatura de la columna de 40 °C. La separación se logró usando un gradiente de agua con ácido fórmico al 0,1% (eluyente A) y acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% (eluyente B). El gradiente de elución se programó de la siguiente manera: condiciones iniciales 5% B, seguido de un gradiente lineal hasta 95% B en 15 min. Las condiciones operativas de ESI fueron gas de secado (N2, pureza > 98%): 350 °C y 11 L/min; voltaje capilar 4,0 kV; gas nebulizador 40 psig; Gas envolvente (N2, pureza > 98%): 375 °C y 11 L/min. Los espectros de MS de alta resolución se adquirieron en modo positivo en el rango de 100 a 2400 m/z.

Las muestras clínicas confirmadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar de oro para IS2404 como BU o no BU se analizaron mediante el método f-TLC utilizando el ácido borónico original BA y el ácido borónico más prometedor, BA18, respectivamente. Se analizaron tanto aspirados con aguja fina (PAAF) como muestras de hisopos. La PCR estándar dirigida a IS2404 se realizó de acuerdo con el protocolo descrito por Stinear et al. [46].

La extracción y detección de micolactona mediante la técnica de cromatografía en capa fina fluorescente (f-TLC) se realizó de acuerdo con el protocolo publicado en otro lugar [43]. El etanol que contenía la muestra disuelta se filtró a través de un tapón de algodón en un vial de vidrio. El recipiente de la muestra se enjuagó más con 1 ml de acetato de etilo, que se añadió al vial de vidrio a través de un tapón de algodón, y el contenido se evaporó hasta sequedad a presión reducida de aproximadamente 10 a 15 mmHg usando un evaporador rotatorio. Para separar cualquier sólido contaminante del líquido, se agregaron 100 µl de solución de hexano/éter (1:1) al vial de vidrio, se enjuagó y se transfirió mediante microjeringa a un vial de vidrio limpio que se secó al aire. Después de la evaporación, se añadieron 50 µl de hexano/éter (1:1) a la muestra seca y se colocaron 10 µl de la muestra resuspendida en una placa de TLC sin colorante fluorescente de 3,3 x 6,6 cm (TLC Silica gel 60, EMD Millipore, Darmstadt). , Alemania; Gibbstown, Nueva Jersey, EE. UU.) junto con 50 ng de micolactona sintética A/B estándar en acetato de etilo y una mancha conjunta de 10 μl de muestra con 50 ng de micolactona sintética A/B. La placa se reveló en cloroformo/hexano/metanol (5:4:1; v/v/v) hasta que el borde delantero alcanzó la parte superior de la placa, se secó al aire y se sumergió en una solución 0,1 M de BA y (9 Ácido ,9-difenil-9H-fluoren-4-il)borónico (BA18) en acetona, luego se calentó durante 60 sa 100 °C en una placa caliente. El lado de vidrio de la placa se limpió con acetona sobre una toalla de papel. La placa se colocó sobre una lámpara UV con un filtro de 365 nm. La banda fluorescente con un factor de retención de 0,23 de la muestra del paciente se comparó con la de los estándares para confirmar la presencia de micolactona. Dos analistas de laboratorio leyeron de forma independiente las placas de f-TLC antes de informar los resultados. Los analistas de laboratorio que trabajaron tanto en las muestras de f-TLC como en las de PCR estaban cegados a cierta información clínica relevante (excepto la edad y el sexo), así como a los resultados de las pruebas de diagnóstico de cada uno de ellos. Esto fue para garantizar que no hubiera sesgo de diagnóstico [43].

Se obtuvieron los perfiles de TLC de veintiséis ácidos arilborónicos disponibles comercialmente (documento adicional 1, Tabla S1) y sus perfiles de intensidades de bandas de fluorescencia se compararon con BA. Una comparación visual de bandas fluorescentes en todos los perfiles de TLC indica que tres de los ácidos borónicos (BA15, BA18 y BA21) fueron visualmente superiores a BA. Dieron bandas de fluorescencia amarillas excelentes y muy intensas sobre un fondo azul de la placa de TLC bajo luz UV de 365 nm que BA (Tabla 2). Tras estos prometedores resultados, los tres fueron seleccionados para realizar más estudios espectroscópicos y de cuantificación.

A partir de la concentración de trabajo preparada de 10 ng/μL de micolactona sintética, se detectaron en la placa de TLC varios volúmenes que oscilaban entre 1 μL y 9 μL, que corresponden a 10 ng - 90 ng, utilizando micropipetas calibradas de 1 a 5 μL (Drummond Scientific). Al igual que la observación anterior, los tres ácidos borónicos dieron bandas fluorescentes más intensas en comparación con BA para todas las concentraciones. De los tres nuevos, BA18 produjo las bandas de fluorescencia más visiblemente intensas (Fig. 4).

Perfiles de TLC representativos después de experimentos por triplicado para cada ácido borónico (BA, BA15, BA18 y BA21). Comparación del ácido borónico (BA) original con los tres ácidos borónicos más prometedores (BA15, BA18 y BA21) para la detección de micolactona sintética A/B. Se colocaron varios volúmenes (1 – 9 µL) de la solución de trabajo de micolactona A/B (10 ng/mL) en una placa de cromatografía en capa fina de gel de sílice, sumergida en una solución 0,1 M de ácidos borónicos (BA, BA15, BA18 y BA21), eluido con cloroformo/hexano/metanol (5:4:1; v/v/v), calentado a 100 °C e iluminado a 365 nm con un transiluminador UV de mesa (lámpara UV UVLM-28 EL Series 365/ 302 nm (8 vatios)

A continuación, realizamos mediciones UV-vis para determinar los espectros máximos de absorción de la micolactona A/B y los aductos de ácido micoborónico. Los espectros UV-vis de la micolactona libre A/B y sus aductos de ácidos borónicos se muestran en la Fig. 5. Los máximos de absorción (λmax) de la micolactona libre A/B fueron 362 nm, mientras que los valores de 272 nm, 270 nm y Se obtuvieron 286 nm respectivamente para myco-BA15, myco-BA18 y myco-BA21.

Espectros de absorción de complejos de micolactona A/B y ácido micoborónico. A (a) micolactona A/B en MeOH (λmax 362 nm); (b) micolactona A/B – complejo de boronato BA15 en MeOH ((λmax 272 nm); (c) micolactona A/B – complejo de boronato BA18 en MeOH ((λmax 270 nm); (d) micolactona A/B – boronato BA21 complejo en MeOH (λmax 286 nm). B Espectros de absorción (a) micolactona A/B en MeOH (λmax 362 nm); (b) complejo de micolactona A/B – boronato BA18 en MeOH ((λmax 270 nm).

En otro experimento, evaluamos la capacidad de mejora de la fluorescencia de la formación de éster de boronato entre la micolactona A/B y nuestros tres ácidos borónicos más prometedores (BA15, BA18 y BA21) (Fig. 6A). Cuando se excitó la micolactona A/B a 365 nm en ciclohexano, el pentaenoato produjo una emisión de fluorescencia a 537 nm. Después de acoplar BA18 al 1,3-diol, la intensidad de la fluorescencia aumentó notablemente a la misma longitud de onda (Fig. 6B). También se observó que la intensidad de la fluorescencia aumentó a medida que la concentración de micolactona aumentó de 0 a 20 µg/ml, Fig. 6C. Cuando se representó gráficamente la intensidad de fluorescencia a 537 nm frente a la concentración de micolactona, se obtuvo una curva de calibración lineal con un coeficiente de regresión de 0,93 (Fig. 6D).

Espectros de emisión de fluorescencia en ciclohexano registrados a temperatura ambiente con el espectrofluorímetro Horiba Jobin Yvon (HJY) Fluoromax-3. Longitud de onda de excitación 365 nm (ancho de la rendija de excitación 5 nm, ancho de la rendija de emisión 10 nm). A (a) complejo de boronato de micolactona A/B-BA; (b) complejo de boronato micolactona A/B-BA15; (c) complejo de boronato micolactona A/B-BA18; (d) complejo de boronato micolactona A/B-BA21; (λmáx 534 nm); B Espectros de emisión de fluorescencia (a) BA18; (b) micolactona A/B en ciclohexano (λmax 537 nm); (c) complejo de boronato micolactona A/B-BA18 ((λmax 270 nm); C (a) disolvente (ciclohexano); (b) BA18 libre (0,10 mol dm-3); (c) micolactona libre (32 µg/ml ); (d–h) Complejos de micolactona A/B-ácido borónico 18, la concentración de BA18 se fijó en 0,10 mol dm-3 en las mezclas, mientras que las concentraciones de micolactona fueron de 4 µg/ml, 8 µg/ml, 12 µg/ml, 16 µg/ml y 20 µg/ml, respectivamente, en las mezclas; gráfico DA de la intensidad de fluorescencia a 537 nm frente a diversas concentraciones de micolactona A/B

Para examinar la correlación entre los cambios espectrales de excitación y emisión, trazamos el pico de excitación versus el pico de emisión correspondiente para el complejo de boronato mico-BA18 en ciclohexano y metanol respectivamente (Fig. 7A). En el gráfico, observamos un pico de emisión máximo a una longitud de onda más alta (λexmax 537 nm) en comparación con el pico máximo de excitación (λemmax 362 nm). Luego determinamos que el desplazamiento de Stokes para el complejo de boronato mico-BA18 a partir de los picos máximos espectrales de excitación y emisión era de 175 nm. Se observó visualmente una mejora significativa de la fluorescencia en la TLC a 537 nM con (azul) ácido borónico en comparación con el ácido sin (rojo) usando una lámpara UV de 365 nM (Fig. 7B).

A. Espectros de emisión (λmax 537 nm) y su correspondiente excitación (λmax 362 nm) obtenidos para el complejo de boronato mico-BA18 en ciclohexano y metanol, respectivamente; Complejo de boronato B myco-BA18 bajo luz UV de 365 nm

Se realizó un análisis espectroscópico de masas (MS) de alta resolución para confirmar la formación del aducto micolactona-BA15. Primero, se realizó un análisis MS de micolactona A/B y el cromatograma obtenido se muestra en la (Figura S1). El pico del ion molecular se obtuvo a m/z 765,4760 con una fórmula de C44H70O9Na que corresponde al aducto de sodio de la micolactona A/B. Esto es consistente con la literatura publicada anteriormente sobre la toxina [7]. Luego, se llevó a cabo una reacción química según la Fig. 8 entre la micolactona A/B y B15, después de lo cual se repitió el análisis con espectrómetro de masas.

Reacción de complejación propuesta entre boronato 1,3-dioles de micolactona A/B y BA15 para formar aducto de boronato cíclico

El éxito de la reacción se confirmó mediante análisis HR-MS. Los resultados mostraron que el aducto de éster de boronato mico-BA15 se formó como se muestra en la Fig. 9 a continuación y en el documento adicional 1, Figura S2. Una nueva señal m/z observada en 1241,6823 correspondiente a [M + Na]+ se atribuye a la mico- Aducto de sodio BA15 con fórmula elemental C80H92B2O9Na, confirmando la formación del aducto requerido. Además, los datos de MS corroboraron firmemente los cambios de intensidad observados en experimentos UV-vis y fluorescentes.

Espectro de masas de ionización por electropulverización (ESI) del aducto de boronato de micolactona A/B-BA15

Se realizó un estudio comparativo entre el prometedor ácido borónico (BA18) y el ácido borónico original (BA) utilizando el método f-TLC en cinco (5) pacientes diferentes con BU confirmados con PCR positiva. Se realizaron dos conjuntos de mediciones (Fig. 10), primero, se usó el BA original (panel superior) para formar los aductos de acuerdo con los protocolos descritos previamente, seguido de B18 (panel inferior). Al igual que los resultados obtenidos con muestras no clínicas, B18 mostró una intensidad mejorada de la mancha del aducto de mico-B18 en comparación con BA. Además, fue más fácil interpretar los perfiles de TLC de las muestras con interferencia de fondo ejemplificada por identificadores únicos SA y LN respectivamente. Además, se analizaron cuatro (4) muestras diferentes de control negativo de PCR que no son BU utilizando nuestro ácido borónico BA18 más prometedor para permitir la comparación con los casos positivos (Fig. 11). Aquí, vale la pena señalar que a pesar de las interferencias de fondo resultantes de los lípidos del tejido humano extraídos conjuntamente de las muestras, los perfiles de TLC indicaron claramente resultados negativos porque el BA18 es fuertemente fluorescente en comparación con el BA original presentado en el panel superior. de la figura 10.

Placas f-TLC de muestras clínicas de 5 casos diferentes de BU confirmados con PCR positivos. Cada placa de TLC está marcada con tres puntos, Myco, S y CS para micolactona sintética A/B, muestra y co-punto respectivamente. Las muestras se aplicaron a la misma concentración y las placas se revelaron usando cloroformo/hexano/metanol (5:4:1; v/v/v).

Placas f-TLC de muestras clínicas de 4 casos distintos de BU confirmados con PCR negativa negativa. Cada placa de TLC está marcada con tres puntos, Myco, S y CS para micolactona sintética A/B, muestra y co-punto respectivamente. Las muestras se aplicaron a la misma concentración y las placas se revelaron usando cloroformo/hexano/metanol (5:4:1; v/v/v).

Antes de la observación directa bajo una luz UV de 365 nm, se llevaron a cabo reacciones de complejación fluorescente de varios ácidos arilborónicos disponibles comercialmente con los restos de 1,3-diol en la estructura de micolactona A/B en una superficie de TLC. La micolactona A/B es débilmente fluorescente en su forma libre; sin embargo, se vuelve fluorescente cuando se une a un ácido borónico apropiado. BA ha sido el ácido borónico elegido para el método f-TLC [19].

La regla de Woodward-Fieser se ha empleado para correlacionar transiciones electrónicas y estructuras de cetonas α,β-insaturadas, así como para pronosticar la posición de la banda de longitud de onda más larga π → π* de estos compuestos [47, 48]. Aquí, utilizamos la regla de Woodward-Fieser para calcular una longitud de onda empírica predicha para la transición electrónica de micolactona de menor energía π → π*. Para los ésteres α,β-insaturados el valor base es 215 nm. Se agregaron un total de 4 dobles enlaces adicionales de la región pentaenoato (+ 30 cada uno) y 3 dobles enlaces sustituidos con metilo que contribuyen + 18 cada uno. La suma del máximo de absorción calculado fue de 367 nm en comparación con el valor experimental de 362 nm medido en UV. Esto es consistente con el análisis UV-vis de la cadena lateral de ácidos grasos de la micolactona A/B [44]. Estos hallazgos demuestran que aunque se forman 2 boronatos cíclicos, uno en el diol de la cadena lateral sur y el otro en la cadena lateral norte, solo el boronato de la cadena lateral sur con el cromóforo fue excitado por irradiación a través de un filtro de 365 nm. Sin embargo, el boronato de la cadena superior no se excitó y, por tanto, no contribuyó al aumento de la fluorescencia bajo luz ultravioleta [49]. El arilboronato formado tiene el potencial de mejorar la emisión de fluorescencia [44, 45]. Esto se debe a que la excitación de la micolactona sola presentó una fluorescencia débil a 537 nm con un desplazamiento de Stokes de 175 nm (Fig. 7A). Sin embargo, después de que se desencadenó la formación de complejos con el ácido borónico, se observó una mejora significativa de la fluorescencia al mismo 537 nm, y la fluorescencia también se observó visualmente en TLC usando una lámpara UV, como se muestra en la Fig. 7B. Por lo tanto, el cambio en la intensidad de fluorescencia de la micolactona A/B se atribuye a una transferencia de energía desde el motivo pentaenoato excitado que sirve como fluoróforo a un aceptor fluorogénico en forma de ácido arilborónico (BA18) [19].

Se seleccionaron veintiséis ácidos arilborónicos disponibles comercialmente como alternativas potenciales para BA. Se realizaron análisis de TLC de los ácidos borónicos adquiridos y se compararon sus perfiles de intensidades de bandas de fluorescencia con el BA original. Los ácidos borónicos forman fácilmente complejos de éster de arilboronato con micolactona A/B y tres de ellos dieron intensidades de banda de fluorescencia superiores. Una repetición de la complejación de los ácidos borónicos BA, BA15, BA18 y BA21 en BA diluido en serie de 10 ng/μL – 90 ng/μL dio resultados similares con BA18 emergiendo como las bandas de fluorescencia más visiblemente intensas.

Cuando se realizaron mediciones UV-vis con micolactona A/B y aductos de ácido micoborónico. Se obtuvieron máximos de absorción (λmax) de 362 nm para la micolactona A/B, mientras que los de BA15, BA18 y BA21 fueron de 272 nm, 270 nm y 286 nm respectivamente. Aplicando la regla de Woodward-Fieser, sólo el boronato de la cadena del lado sur con el cromóforo fue excitado por irradiación a través de un filtro de 365 nm mientras que el del lado norte no.

La intensidad de fluorescencia de la formación de éster de boronato entre la micolactona A/B y los ácidos borónicos aumentó a medida que aumentó la concentración de micolactona y la formación del aducto de éster de boronato de mico-BA15 se confirmó mediante HR-MS. Finalmente, un estudio comparativo entre BA18 y BA utilizando muestras de pacientes confirmadas por PCR proporcionó una intensidad mejorada del aducto y perfiles de TLC de las muestras más fáciles de interpretar, incluso para aquellos con interferencia de fondo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

Cromatografía en capa fina fluorescente

Cromatografía de capa fina

Úlcera de Buruli

Úlcera no Buruli

Espectrometría de masas de alta resolución

micobacteria ulcerosa

Reacción en cadena de la polimerasa

Ultravioleta

Amplificación isotérmica mediada por bucle

Ácido ribonucleico

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Nos gustaría agradecer al fondo Global Challenge Research (GCRF) (RBV1, UG) por apoyar el trabajo. Los autores agradecen al profesor Kishi Yoshito por la generosa donación de micolactona sintética A/B a través de la Organización Mundial de la Salud para el estudio. Los autores también agradecen a Kabiru Mohammed Abass y a todo su equipo en el Hospital Presbiteriano Agogo, Ghana, de donde procedieron las muestras de los pacientes. Sobre todo, estamos en deuda con todos los pacientes.

La financiación para el estudio fue proporcionada por el fondo Global Challenge Research (GCRF) (164187, Universidad de Sheffield, RBV1, UG).

Departamento de Química, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad de Ghana, PO Box LG 56, Legon, Accra, Ghana

Gideon A. Akolgo y Richard K. Amewu

Departamento de Química, Universidad de Sheffield, Dainton Building, Sheffield, S3 7HF, Reino Unido

Benjamín M. Partridge y Timothy D. Craggs

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GAA, BMP, TDC y RKA conceptualizaron la idea del proyecto. GAA., BMP, TDC y RKA diseñaron el proyecto y GAA realizó predominantemente trabajo de laboratorio, analizó e interpretó los datos y preparó el borrador original del manuscrito. Todos los autores hicieron contribuciones importantes y leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Richard K. Amewu.

Este estudio se llevó a cabo en el Departamento de Química de la Universidad de Ghana. Se tomaron muestras clínicas en el Hospital Presbiteriano de Agogo, Ghana, como parte del procedimiento de diagnóstico de rutina y confirmación de caso recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y se enviaron al DC para análisis f-TLC. El estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Conmemorativo de Investigación Médica Noguchi (NMIMR) (Número de estudio: NMIMR-IRB CPN 024/18–19). Además, se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los participantes adultos y los tutores legales, o los padres de cualquier niño participante proporcionaron su consentimiento informado por escrito en nombre del niño. Para garantizar el anonimato, la información personal, como nombres y otros identificadores personales asociados con las muestras de los pacientes, se reemplazó por códigos.

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lista de intentos de ácidos borónicos con sus correspondientes TLC. Figura S1. Espectro de masas ESI de micolactona A/B. Figura S2. Espectro de masas ESI del aducto de boronato de micolactona A/B-BA15.

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Reimpresiones y permisos

Akolgo, GA, Partridge, BM, D. Craggs, T. et al. Ácidos bóricos alternativos en la detección de Micolactona A/B mediante el método de cromatografía en capa fina (f-TLC) para el diagnóstico de la úlcera de Buruli. BMC Infect Dis 23, 495 (2023). https://doi.org/10.1186/s12879-023-08426-2

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Recibido: 28 de diciembre de 2022

Aceptado: 25 de junio de 2023

Publicado: 27 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12879-023-08426-2

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